alt=|miniaturadaimagem|Replication: replicação; Hemimethylated DNA: ADN hemimetilado; New strands are methylated and strands are now indistinguishable: As fitas novas são metiladas e agora são indistinguíveis A metilação do DNA é um tipo de modificação química do ADN que pode ser herdada e subsequentemente removida, sem alterar a sequência original da molécula. Como tal, é interpretada pelo código epigenético e é também o mecanismo epigenético mais bem caracterizado.
A metilação envolve a adição de um grupo metil ao ADN; por exemplo, ao carbono número 5 da anel de pirimidina da citosina; neste caso, em eucariotos, com o efeito específico de atenuar a expressão gênica pela inibição da transcrição. A metilação do ADN na posição 5 da citosina foi encontrada em todos os vertebrados examinados. Nos tecidos somáticos do adulto, a metilação do ADND tipicamente ocorre num contexto de um dinucleotídeo CpG; a metilação não-CpG é prevalente em células-tronco embrionárias. A adição de um grupo metila ao ADN também desempenha papeis no imprinting genômico, e um desequilíbrio no padrão de metilação de um indivíduo está relacionado ao desenvolvimento de neoplasmas.
Em plantas, as citosinas são metiladas simetricamente (CpG ou CpNpG) ou assimetricamente (CpNpNp), onde N pode ser qualquer nucleotídeo que não seja guanina. As bactérias E. coli tem seu sistema de metilação do ADN bem caracterizado, e são conhecidas duas funções para essas modificações. São a base do sistema de modificação-restrição, sinalizando pareamentos incorretos de bases durante a replicação do ADN. Com seu ADN metilado, enzimas de restrição de E. coli são capazes de distinguir o próprio ADN de um ácido nucleico exógeno, clivando então apenas o material invasor. A modificação é promovida pela Dam (ADN adenina metilase) nas sequências (5')GATC(3'), após a replicação, permitindo que por um espaço de tempo, eventuais pareamentos incorretos de nucleotídeos sejam detectados e corrigidos.
Bases moleculares da metilação do ADN alt=|miniaturadaimagem|383x383px|Cytosine: Citosina; 5-methyl cytosine: 5-metilcitosina; Uracil: Uracila; Thymidine: Timina; Deamination: Desaminação; UNG Repair: Reparo por Uracila DNA Glicosilase; DNA Replication: Replicação do ADN; Demethylase: Desmetilase; DNA MTase: ADN Metil Transferase; SAM: S-adenosil-L-metionina; SAH: S-adenosil-L-homocisteína; Hydrolytic Deamination: Desaminação Hidrolítica Em células de vertebrados, a metilação de citosinas existe como um mecanismo pelo qual padrões de expressão gênica podem ser transmitidos para células-filha. A metilação de uma citosina não afeta o pareamento do nucleotídeo no duplex, e é análogo à relação entre timinas e uracilas.
A transformação de citosina à 5-metilcitosina se dá por enzimas denominadas ADN metiltransferases - metilases, simplificadamente -, que podem promover a manutenção do padrão de metilação, garantindo sua herdabilidade após a replicação, ou introduzir metilações de novo durante o desenvolvimento embrionário.
De modo geral, a metilação do ADN está associada à mecanismos de silenciamento genético. A existência de uma 5-metilcitosina ocupando a cavidade maior da dupla fita dificulta o acesso dos fatores de transcrição gerais, ou fatores regulatórios que dariam início à expressão do gene, reprimindo a síntese do mRNA correspondente. Soma-se a isso a existência de proteínas remodeladoras da cromatina que reconhecem as ilhas CpG metiladas no ADN e promovem alterações químicas nas histonas, induzindo a configuração de heterocromatina, silenciando um gene por modificações conformacionais do conjunto de nucleossomos.
ADN metiltransferases Metilases de manutenção A metiltransferase responsável pela manutenção do estado de metilação do ADN em humanos é a Dnmt1, que atua constitutivamente sobre a dupla fita hemimetilada, após a replicação. A Dnmt1 reconhece as regiões onde os dinucleotídeos CpG estão metilados na fita parental, e promove a metilação do carbono 5 da citosina na fita recém incorporada (pareada com G do CpG molde), garantindo assim a conservação do estado de metilação após a replicação, o que pode por exemplo, assegurar a manutenção das características de uma célula diferenciada. alt=|miniaturadaimagem|382x382px|Esquema de metilação de manutenção de ADN por uma metiltransferase de manutenção, como Dnmt1. Os pinos pretos representam grupos metila. Os CpGs que foram metilados em ambas as cadeias do ADN original (à esquerda) serão metilados em ambas as cadeias do ADN filho (à direita), enquanto CpGs que não foram metilados no ADN original não serão metilados no ADN-filho. As metiltransferases de manutenção reconhecem CpGs metilados de lado único e metilam a cadeia complementar desses CpGs (setas vermelhas)
Metilases de novo As ADN metiltransferases de novo tem como substrato as sequências não metiladas na dupla fita, e inserem um grupo metil na posição 5 das citosinas de uma das fitas. Em camundongos, foram identificadas duas metilases de novo: Dnmt3A e Dnmt3B, sendo que cada uma possui sítios alvos diferentes.
Após a metilação de novo da citosina dos dinucleotídeos CpG, metilases de manutenção atuam sobre o duplex hemimetilado, concluindo o processo.
As metilases de novo são particularmente relevantes durante o desenvolvimento embrionário, uma vez que logo após a fertilização ocorre uma desmetilação sistemática no genoma induzida pela atenuação da expressão de Dnmt1, inviabilizando a metilação de manutenção, em conjunto da ação de ADN desmetilases. O estado de metilação das ilhas CpG de um indivíduo é estabelecido pela Dnmt3A e Dnmt3B nas fases seguintes do desenvolvimento, e então propagado pela Dnmt1.
Ilhas CpG alt=|commoldura|Evolução das ilhas CpG (CpG site: sítio CpG; Methylated CpG site: sítio CpG metilado; Ancestral genome: genoma ancestral; Modern genome: genoma moderno; Evolutionary timescale: escala de tempo evolucionária; CpG island: ilha CpG) A organização das ilhas CpG em mamíferos é devida ao funcionamento das enzimas de reparo de ADN e seus reflexos ao longo do tempo evolutivo. As 5-metilcitosinas tendem a ser excluídas do genoma pois, diferentemente das citosinas, quando sofrem uma desaminação não geram um componente estranho à molécula de ADN, e a mutação é transmitida pela replicação.
O produto da desaminação de uma citosina é uma uracila, e por não compor a molécula de ADN normalmente, é reconhecida pela uracila ADN glicosilase, que a remove, e então uma nova citosina é inserida, concluindo o reparo da mutação. No entanto, quando uma 5-metilcitosina é desaminada, o produto da transformação é uma timina, gerando uma mutação indistinguível de algum outro resíduo do mesmo nucleotídeo. Durante a replicação, a T mutante será pareada com uma adenina, substituindo o antigo par C-G por um par T-A.
Durante o curso evolutivo, estima-se que três de cada quatro CpGs tenham se perdido, deixando os vertebrados com uma deficiência notável nessas sequências. Os dinucleotídeos remanescentes estão em ilhas CpG, em geral localizadas em regiões relacionadas à promotores de genes. Em humanos, 60% das regiões promotoras estão circundadas por ilhas CpG, sendo que todos os genes constitutivos se encontram nesse quadro, devido à menor taxa de mutação quando comparada com a de CpGs contendo uma 5-metilcitosina.
O estado não metilado é mantido por proteínas que reconhecem sequências específicas para associação ao ADN, onde para muitas delas, dinADN desmetilases, convertendo as 5-metilcitosinas em hidroximetil-citosinas, que posteriormente são substituídas por C. alt=|miniaturadaimagem|425x425px|I) A metilação do ADN e das histonas induzem os nucleossomos a se condensarem rigidamente. Fatores de transcrição não acessam o DNA, atenuando a expressão gênica. (Histone tail: cauda da histona; Methyl group: grupo metil; DNA inaccessible, gene inactive: DNA inacessível, gene inativo) II) A acetilação das histonas resultam num afrouxamento do empacotamento dos nucleossomos devido a repulsão eletrostática entre as cargas negativas dos grupos acetil, e o esqueleto de açúcar-fosfato do DNA. Fatores de transcrição acessam o DNA e o gene é expresso. (Acetyl group: grupo acetil; DNA accessible, gene active: DNA acessível, gene ativo) As ilhas CG não-metiladas contribuem para a ativação da transcrição, sendo recrutadoras de proteínas que promovem modificações químicas nas histonas induzindo a conformação de eucromatina.
Acoplamento entre metilação das histonas e do ADN Para loci silenciados, na conformação de heterocromatina, a metilação dos resíduos K9 das histonas H3 é diretamente relacionada à metilação dos dubletes CpG. Quando H3K9 se encontra metilada, sua afinidade por HP1 (Proteína 1 de Heterocromatina) é impulsionada, direcionando a associação da proteína remodeladora da cromatina à estrutura a ser silenciada. Na etapa seguinte, metilases do ADN (ADN Metiltransferases, DNMTs) são recrutadas e a expressão do gene é ainda mais atenuada.
A metilação de H3K9 e do ADN são processos sinérgicos que culminam no silenciamento gênico, onde um resíduo de aminoácido metilado sinaliza para a atividade de DNMTs, e dinucleotídeos CG metilados promovem a atividade de histonas deacetilases e metilases. O sistema de silenciamento gênico por metilação é altamente conservado em fungos, plantas e células animais, modulando a taxa de transcrição de genes processados pelas RNA polimerases I e II, e mantendo a heterocromatinas constitucionais do genoma.
Métodos de análise Os primeiros métodos para detectar metilação do ADN forneciam informações pouco específicas, como nível total de metilação no genoma, ou a proporção entre citosinas metiladas e não metiladas em determinados sítios de restrição. O surgimento de novas tecnologias de sequenciamento possibilitou a análise de padrões de metilação no genoma total de organismos com resolução de pares de bases individuais. As técnicas são diversas e existem numerosos protocolos disponíveis, cada um com vantagens e limitações; a escolha apropriada depende das particularidades do genoma a ser analisado e do objetivo final. Os protocolos, em geral, requerem um pré-tratamento que permita distinção entre citosinas metiladas e não metiladas. Os principais são digestão por endonucleases, conversão por bissulfito e métodos baseados em enriquecimento por afinidade. A seguir serão brevemente descritos os pré-tratamentos e métodos de sequenciamento e hibridização.
Digestão por endonucleases As endonucleases de restrição, ou enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios específicos, e algumas delas são inibidas por metilação da citosina em regiões CpG. Os cortes resultantes, portanto, fornecem informações sobre os padrões de metilação. A análise pode ser feita através de amplificação por PCR e eletroforese em gel, ou hibridização em Southern Blot .
Conversão por Bissulfito O bissulfito de sódio converte citosinas não metiladas de dinucleotídeos CpG em uracila, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Algumas técnicas que podem ser utilizadas para detecção de metilação após o tratamento com bissulfito são clonagem e sequenciamento, sequenciamento direto e espectrometria de massas.
Enriquecimento por afinidade MeDIP (Imunoprecipitação de DNA metilado) e MIRA (Ensaio de recuperação de ilhas CpG metiladas) são técnicas baseadas em imunoprecipitação. MeDIP consiste na utilização de anticorpos específicos para citosinas metiladas, que ligam apenas em DNA de fita simples. O DNA é, então, hibridizado em microarranjos de DNA (DNA microarray). MIRA utiliza o complexo proteico MBD2b/MBD3L1, que tem alta afinidade por trechos CpG metilados em DNA de dupla fita.
Análise de metilação global Cromatografia líquida Hidrólise do DNA, desoxirribonucleosídeos separados por HPLC, identificação de bases por absorbância. Maior especificidade pode ser alcançada acoplando HPLC com espectrômetro de massas.
Cromatografia em camada delgada