miniaturadaimagem|Células pluripotentes induzidas em cultura Células tronco pluripotente induzidas (do inglês, induced pluripotent stem cells, IPS), são células de organismos adultos que, através da expressão de fatores de transcrição específicos, ganham uma característica bastante particular de célula embrionária, a pluripotência. Por conta de tal capacidade é esperado que as células-tronco pluripotente induzidas revolucionem a medicina regenerativa num futuro próximo GOMES K. M. S., “Induced pluripotent stem cells reprogramming: Epigenetics and applications in the regenerative medicine”. Study conducted at Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brazil, 2016.
A tecnologia capaz de obter células-tronco pluripotentes foi uma grande descoberta realizada por Takahashi e Yamanaka, que demonstraram a indução de pluripotência em células embrionárias de rato ou fibroblastos adultos através da introdução de quatro fatores de transcrição Takahashi K., Yamanaka S. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell. 126 (4): 663–76. doi:10.1016/j.cell.2006.07.024. PMID 16904174. Por conta desta descoberta, Yamanaka foi o ganhador do Prêmio Nobel de Fisiologia do ano de 2012, junto com John B. Gurdon, que demonstrou a reversibilidade da diferenciação celular transferindo o núcleo do epitélio intestinal de um sapo para um zigoto, que originou um sapo adulto normalmente Obtido em <https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2012/press-release/> 28/03/2019 às 20:00.. O estudo feito por Takahashi abre uma nova gama de possibilidades não só no campo de pesquisa da Biologia do Desenvolvimento, ajudando a elucidar detalhes do processo de diferenciação e desdiferenciação celular, mas também no campo da medicina. Para realização de pesquisas, a obtenção de células-tronco embrionárias exige a destruição, ou pelo menos algum tipo de manipulação de embriões ainda não implantados Klimanskaya, I. “Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres”. Vol. 444|23 November 2006| doi:10.1038/nature05142, o que acaba gerando debates éticos. Entretanto, como a técnica de Takahashi não exige tais manipulações de embriões humanos, o debate acerca de questões éticas não é gerado. Assim, abrem-se portas para diversas pesquisas a fim de entender melhor os mecanismos de diferenciação celular, bem como aplicações práticas no campo da medicina, uma vez que há a possibilidade de gerar células pluripotentes através da desdiferenciação de células do próprio paciente, o que eliminaria problemas de rejeição e potencialmente facilitaria tratamentos como por exemplo, lesões na espinha Trounson, A., DeWitt, N. D. “Pluripotent stem cells progressing to the clinic”. Nature Reviews Molecular Cell Biology volume17, pages194–200 (2016).
Fatores de indução de pluripotência
De acordo com os estudos de Yamanaka e Yu, sabe-se que é possível que uma célula adulta possa recuperar sua capacidade pluripotente embrionária, através da expressão de quatro fatores trans de transcrição, são eles OCT4 (também conhecido como POU5F1), SOX2, NANOG, MYC, KLF4, e LIN28 Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. (2007). “Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells”. Science 318, 1917–1920.Takahashi, K., et al. (2007). “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors”. Cell 131, 861–872.. Os fatores de transcrição OCT4, SOX2, NANOG e LIN28 são suficientes para a desdiferenciação celular , ou seja, a expressão destes fatores é o bastante para que uma célula adulta recupere sua capacidade pluripotente embrionária. Este procedimento é descrito ainda em linhagens celulares como fibroblastos de pele ou outros tipos celulares, que requerem uma intervenção cirúrgica, entretanto é desejado para tratamentos médicos que a coleta de células para serem desdiferenciadas seja o menos invasiva possível, pensando nisso, um grupo utiliza de células do sangue de cordão umbilical para o procedimento e, eles obtêm não só células que expressam fatores de pluripotência, mas que também são juvenis, o que resolve uma preocupação importante acerca da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas, que é o fato da desdiferenciação feita em células somáticas de um adulto estar sujeita ao acúmulo de bastante mutações, o que levanta possibilidade do desenvolvimento de cânceres Haase, A. et al.”Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Cord Blood”. Cell Stem Cell 5, 434–441, October 2, 2009.. A seguir serão um pouco mais detalhados os fatores de transcrição OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, MYC e KLF4:
OCT4: Octamer binding transcription factor 4 (fator de transcrição 4 ligante de octâmero). Este fator pertence à família de fatores de transcrição POU (Pit-Oct-Unc). A característica principal dos fatores de transcrição dessa família é a capacidade de ligar-se em uma sequência motivo de octâmero conservada “AGTCAAAT” Pesce, M. and H Scholer. “Oct4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development”. Stem Cells 2001; 19: 271-8.. A expressão deste gene controla a pluripotência de forma quantitativa, ou seja, níveis elevados de expressão do OCT4 leva à diferenciação de células-tronco embrionárias em linhagens da endoderme e mesoderme. Níveis baixos de expressão do OCT4 leva à diferenciação em TE (trophectoderm). E por fim níveis “normais” da expressão de OCT4 retém o estado pluriponte de células-tronco Niwa, H. “Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells”. Cell Str & Func 2001; 26:13748.Pan, G. J. “Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4”. Cell Research (2002); 12(5-6):321-329.
SOX2: Sex determining region Y-box 2 (região determinante do sexo Y-box 2). Este fator de transcrição pertence à família SOXB1 e, possui grande importância na manutenção de células-tronco embrionária e também de células neurais Zhanf, S. Cui, W. “Sox2, a key factor in the regulation of pluripotency and neural differentiation”. World J Stem Cells 2014 July 26; 6(3): 305-311. Essa família de proteínas apresenta domínios ligantes ao DNA bem conservados, os chamados HGM (High-mobility group/ grupo de alta-mobilidade) box, que contém domínios de cerca de 80 aminoácidos Obtido em <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6657> dia 31/03/2019 às 18:22.. Este fator, bem como sua interação com OCT4, é visto como um grande promissor no avanço na obtenção de células-tronco pluripotente induzidas, para isso é necessário ainda grande estudo em seus mecanismos regulatórios da expressão gênica Rizzino, A. “Sox2 and Oct-3/4: a versatile pair of master regulators that orchestrate the self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells”. WIREs Systems Biology and Medicine. Volume 1, September/October 2009..
NANOG: Este fator de transcrição possui este nome em homenagem à uma terra de uma lenda Irlandesa que possui a fonte da juventude eterna, Tír Na nÓg Allouba M. H. et al. “NaNog: A pluripotency homeobox (master) molecule, Global Cardiology Science and Practice 2015:36 http://dx.doi.org/10.5339/gcsp.2015.36. e, é considerado crucial para a indução da pluripotência. Embora sua ausência não cause a diferenciação de células embrionárias e sua presença não aja como gatilho para a desdiferenciação celular, este fator é importante para a transição entre células-tronco embrionárias com pluripotência induzida incompleta, para células-tronco com pluripotência induzida completa. Deste modo ainda possui um papel crucial na reprogramação de células humanas, apesar de possuir um mecanismo de ação ainda pouco elucidado Obtido em <https://www.nature.com/articles/stemcells.2009.118> dia 31/03/2019 às 14:00.. A proteína de Nanog possui ortólogos em humanos, ratos, chimpanzés e cachorros, mas análises filogenéticas mostram que ela não possui nenhum homólogo, o que sugere que esta seja uma proteína com homeobox único. Em termos estruturais, Nanog é uma proteína de três domínios, um N-terminal, com 96 aminoácidos e rico em serina. Um homeodomínio, que mostra alguma semelhança com a família NK2 de genes homeobox, mas que possui uma identidade de aminoácidos de menor que 50%. Por fim um C-terminal, com um domínio bem conservado de 50 aminoácidos com repetição de triptofano a cada 4 aminoácidos PanN, G. and Thomson, J. A. “Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency”. Cell Research (2007) 17:42-49. doi:10.1038/sj.cr.7310125; published online 9 January 2007..
LIN28: essa proteína possui dois parálogos LIN28A e LIN28B em vertebrados, ambos com funções no desenvolvimento embrionário, tumorigênese, e pluripotênci. LIN28 não é considerado um fator de transcrição e regula uma baixa atividade mitocondrial, além de metilação de histonas Zhang, J. et al. “LIN28 Regulates Stem Cell Metabolism and Conversion to Primed Pluripotency”. Cell Stem Cell 19, 1–15, July 7, 2016.. LIN28 é uma proteína ligante de RNA com um cold shock domain (CSD) em beta barril, e uma cisteína cisteína histidina cisteína (CCHC) zinc knuckle domain, que é um domínio encontrado em retrovírus. Ambos os domínios são capazes de ligar-se ao RNA. Atualmente a proteína LIN28 é tida como uma molécula chave que regula a passagem entre a pluripotência e o comprometimento de linhagens celulares Tsialikas, J. and Romer-seibert, J. “LIN28: roles and regulation in development and beyond”. Development (2015) 142, 2397-2404 doi:10.1242/dev.117580..
MYC: é um fator de transcrição que regula milhares de genes em células-tronco pluripotentes e possivelmente contribui para a ação de todos os genes transcritos. MYC possui grande importância na regulação celular e no estabelecimento de um estado de pluripotência. Acredita-se que a elucidação dos mecanismos de ação deste fator venha a ser de grande importância para pesquisas principalmente na área de biologia do câncer Chappell, J. and Dalton, S. “Roles for MYC in the Establishment and Maintenance of Pluripotency”. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a014381.. Em sua estrutura, MYC possui uma região com dois motivos estruturais, uma básica Helix-loop-helix (bHLH) e um zíper de leucina (LZ), o primeiro permite que a MYC se ligue ao DNA enquanto que o segundo motivo permite que a proteína interaja com outro fator de transcrição denominado MAX Blackwood, E. and Eisenman, R. “Max: a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence-specific DNA-binding complex with Myc”. Science. 1991; 251:1211–1217. [PubMed: 2006410].
KLF4: Kruppel-like factor 4 faz parte de uma família de fatores de transcrição que possui grande semelhança com o fator Kruppel de Drosophila melanogaster. Em sua estrutura, KLF4 possui sítios dedo de zinco na porção C-terminal, que permite com que esta proteína se ligue à regiões GC-box e CACCC-box no DNA Bieker J. J. “Kruppel-like factors: three fingers in many pies”. Journal of Biological Chemistry 2001;276(37)34355-34358.. Em humanos, esta proteína possui 513 aminoácidos com peso molecular de aproximadamente 55 kDa, codificada pelo gene KFL4 Obtido em <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=9314> dia 39/03/2019 às 15:00.. Já é sabido que este fator está envolvido em processos celulares tais como, proliferação, diferenciação, apoptose, e reprogramação de células somáticas. Adicionalmente, evidências sugerem que KFL4 seja um supressor de tumores em certos tipos de cânceres, incluindo o câncer colorretal El-karim, E. A. et al. “Krüppel-like factor 4 regulates genetic stability in mouse embryonic fibroblasts”. Molecular Cancer 2013 12:89.
Obtenção de células-tronco pluripotentes induzidas
O procedimento experimental para a obtenção de células-tronco pluripotente induzidas é relativamente simples, porém um pouco demorado. Para ratos esse tempo varia entre 1-2 semanas e, para humanos, entre 3-4 semanas. A obtenção dessas células é feita em quatro etapas, descritas abaixo e mostradas na figura: Isolamento e cultura das células do doador;