A Microscopia confocal é uma técnica imagiológica desenvolvida primariamente por Marvin Minsky, em 1955. Apesar do funcionamento do Microscópio Confocal ser semelhante ao do Microscópio de fluorescência, o primeiro é utilizado para aumentar o contraste da imagem microscópica e construir imagens tridimensionais através da utilização de um orifício de abertura, pinhole, que permite uma grande definição de imagem em amostras mais espessas que o plano focal.
Esta técnica tem vindo a adquirir uma grande popularidade e possui diversas aplicabilidades na ciência, nomeadamente na obtenção de imagens de amostras vivas e de informação computadorizada tridimensional na pesquisa biológica, na análise química e de materiais, principalmente na área de neuroanatomia e neurofisiologia.
thumb|Construção 3D de Células da Mesoderme de Embriões de Galinha (Gallus gallus)
História Lentes Não se sabe ao certo quando as lentes foram inventadas, mas, em 721 a.C, há relatos de um cristal de rocha recortado com propriedades de ampliação. Conhecido, posteriormente, como lente de Lanyard, pensa-se que este objecto possa ter sido a primeira lente criada pelo homem. Contudo, as lentes passaram a ser realmente conhecidas e utilizadas por volta do ano de 1280, em Itália, com a invenção dos óculos. Com sua rápida popularização, logo começaram as primeiras experiências de combinação de lentes para aplicação em instrumentos de ampliação de imagens, resultando na criação do primeiro microscópio composto (com duas ou mais lentes).
Aparecimento do Microscópio A denominação de "microscópio" foi dada pelo membro da Academia de Lincei e médico em Roma a serviço do Papa Urbano VII, Johann Giovanni Faber (1570-1640) de Bamberg em 1624. O substantivo provém da junção de dois vocábulos gregos: micros (pequeno) e skopein (ver, examinar).
O crédito pela invenção do microscópio é dado ao holandês Zacharias Jansen, por volta de 1595. Como era muito jovem na época, pensa-se que o primeiro microscópio, com duas lentes, tenha sido desenvolvido pelo seu pai, Hans Jansen. Porém, era Zacharias que montava os microscópios distribuídos pela realeza europeia, dado que, na altura, o instrumento era considerado um brinquedo, pois possibilitava a observação de pequenos objectos.
Não obstante, a paternidade do microscópio tem sido muito discutida e disputada, uma vez que os italianos atribuem este singular invento ao seu compatriota, fundador do método experimental e da ciência dinâmica e eminente físico e matemático, o famoso Galileu Galilei (1564-1642), natural de Pisa. Segundo testemunhos, Galileu, em 1609, apenas combinou lentes ou cristais de aumento num tubo de chumbo ou papelão, aplicando-as ao estudo da astronomia, embora se tenha apoiado no conhecimento do aparato óptico inventado pelos Jansen. Este instrumento de Galileu permitia um aumento de trinta vezes, sendo ainda considerado o primeiro telescópio produzido.
Mas de facto parece não ser ele o seu inventor, pois o seu contemporâneo Hans Lippershey tinha um telescópio, cujos fundamentos foram indagados por Galileu, construindo, baseado neles, o seu próprio telescópio aperfeiçoado. O facto de ter construído os seus próprios instrumentos, tal como aconteceu com diversos cientistas, não lhe credita obter a patente de inventor, como seus biógrafos pretendem. Pelas computações cronológicas, a invenção do instrumento pertence, de facto, aos Jansen.
Ciência e o Microscópio O século XVII foi um período de grande interesse pelos microscópios. A própria palavra microscópio foi oficializada na época pelos membros da Academia de Lincei, uma importante sociedade científica. Contudo, ainda havia dúvidas sobre a importância do instrumento para a ciência. A ampliação dos objectos, em torno de nove vezes, não permitia observar coisas realmente novas, de tal forma que ainda não se suspeitava que uma estrutura presente em todos os tecidos vivos estaria ao alcance do olho humano com a ajuda dos microscópios: a célula.
Geração Seguinte No final do século XVII, os microscópios sofreram uma mudança no seu desenho básico. Devido provavelmente à instabilidade do sistema lateral de sustentação, passou-se a utilizar um tripé de apoio. O primeiro esquema de microscópio com tripé foi divulgado na Alemanha em 1631. Contudo, somente em 1683, o microscopista inglês John Yarwell construiu o primeiro modelo de que se tem notícia.
Melhorias do Século XVIII O século XVIII foi uma época de melhorias nas lentes e nos microscópios, nomeadamente a nível de estabilidade, precisão de focagem e facilidades de uso. Os instrumentos passaram a ser anunciados em diversas publicações pelo mundo inteiro, e vários microscopistas lançaram os seus modelos. Por volta do ano de 1742, os microscópios que projectavam imagens fizeram grande sucesso. Uma das diversões da época era visitar os espectáculos de projecção microscópica.
Microscópios no Século XIX No século XIX, os fabricantes de microscópios desenvolveram novas técnicas para fabricação de lentes e passaram, também, a utilizar espelhos curvos para melhorar a capacidade de focagem desses instrumentos. Em 1840, os Estados Unidos começaram a fabricar microscópios, uma actividade até então restrita basicamente à Inglaterra. Finalmente, por volta de 1880, os chamados microscópios ópticos atingiram a resolução de 0,2 micrómetros, limite que permanece até aos dias de hoje.
Microscópio de Fluorescência A Microscopia de fluorescência foi inventada há quase um século atrás, quando alguns investigadores experimentavam o uso de luz ultravioleta para obter uma maior resolução. No início, as observações microscópicas eram limitadas aos espécimes que tinham auto-fluorescência, porém rapidamente se começou a estudar corantes com fluorescência. No entanto, só a partir da década de 1940 é que a Microscopia de fluorescência começou a ganhar popularidade, quando Coons e Kaplan apresentaram uma técnica que marcava anticorpos com um corante fluorescente para estudar interacções antigénio-anticorpo, o que promoveu uma profunda alteração no campo da Imunocitoquímica.
A descoberta que realmente trouxe a Microscopia de fluorescência para a vanguarda veio em 1994, quando Chalfie M. et al conseguiram expressar naturalmente uma proteína fluorescente, a proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein - GFP), em organismos vivos. Este foi um marco na evolução desta área, pois permitiu toda uma nova classe de métodos de marcação.
Na história do Microscópio de Fluorescência, a tecnologia foi um trampolim multidisciplinar da Engenharia Óptica, Química e Biologia, em que todas as disciplinas contribuíram para visualizar as substâncias fluorescentes unidas às proteínas, aumentando a compreensão da actividade celular. A importância da Microscopia de fluorescência foi reconhecida recentemente com o prémio Nobel de Química do ano de 2008, que foi concedido pelo desenvolvimento da GFP.Herman, B. Fluorescence Microscopy, 2nd Edition. Sem local: Editora Peperback, sem data.
Microscópio Confocal
O desenvolvimento do Microscópio Confocal foi impulsionado, em grande parte, pelo desejo de se obter uma imagem de eventos biológicos que ocorrem in vivo.Paddock, S. Methods in Molecular Biology – Confocal Microscopy Methods and Protocols; volume 122. New Jersey: Human Press, sem data.
A invenção deste objecto é atribuída a Marvin Minsky que, em 1955, enquanto estudante de pós-doutoramento na Universidade de Harvard, construiu um microscópio com o objectivo de obter uma imagem de redes neurais, utilizando preparações não coradas de tecido cerebral vivo.Claxton, N., Fellers, T., Davidson, M. Laser Scanning Confocal Microscopy. Florida: Department of Optical Microscopy and Digital Imaging, National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University. Recuperado a 2009, Junho 15, de http://www.olympusconfocal.com/theory/LSCMIntro.pdf. Todos os Microscópios Confocais modernos empregam o mesmo princípio da imagiologia confocal patenteada em 1957.
A invenção de Marvin Minsky permaneceu despercebida durante algum tempo, provavelmente devido à falta de fontes de luz intensas necessárias para se obter imagens e de um computador com uma potência suficiente para lidar com grandes quantidades de dados.
Na sequência do trabalho de Marvin Minsky, surgem M. David Egger e Mojmir Petran, no final dos anos 1960, que fabricam um Microscópio Confocal de feixes múltiplos, onde utilizaram um disco giratório (disco de Nipkow) para examinar secções de tecido cerebral não corado e células ganglionares.
Prosseguindo nesta área, foi em 1973 que M. David Egger desenvolveu o primeiro Microscópio Confocal a laser mecanicamente digitalizado e publicou as primeiras imagens reconhecíveis de células.
Durante o final dos anos 1970 e na década de 1980, os avanços da informática e da tecnologia do laser, juntamente com os novos algoritmos para manipulação digital de imagens, levou ao aumento do interesse pela Microscopia Confocal.
Pouco tempo depois da patente de Marvin Minsky ter expirado, os desenhos práticos do Microscópio Confocal a laser foram traduzidos em instrumentos de trabalho por vários investigadores. O físico holandês G. Fred Brakenhoff desenvolveu um Microscópio de Varrimento Confocal em 1979. Quase em simultâneo, Colin Sheppard contribuiu para a técnica com a Teoria da Formação da Imagem. Tony Wilson, Brad Amos e John White alimentaram o conceito e, mais tarde (durante o final dos anos 1980), demonstraram a utilidade da Imagem Confocal Latente no exame de amostras biológicas fluorescentes.Paddock, S., Claxton, N., Darzynkiewicz, Z. Cytometry, 3rd Edition, Volume 63. Sem local: Elsevier. Recuperado a 2009, Junho 15, de http://books.google.pt/books?id=7KoUF8GrfQYC&printsec=frontcover. thumb|Primeira Página da Patente de Marvin Minsky Sobre o Microscópio Confocal
Enquanto investigadores em Cambridge, Brad Amos e John White tentaram observar as primeiras divisões mitóticas dos embriões de C. elegans, através de imunofluorescência com anticorpos antitubulina, numa tentativa de determinar os planos de clivagem das células. No entanto, não conseguiram atingir o seu objectivo, visto que a maioria da fluorescência observada estava fora do plano de focagem. Foi então que estes investigadores adoptaram a técnica de Microscopia Confocal proposta por Minsky. Em 1987, foi construído o primeiro Microscópio Confocal com a capacidade de produzir imagens com bastante utilidade, combinando tecnologias de laser, de computador e de microelectrónica. Amos e White construíram o primeiro protótipo do Microscópio Confocal que incorporava estas tecnologias e conseguiram, finalmente, obter imagens com melhor focagem dos embriões de C. elegans. Foi, então, em 1987 que os primeiros instrumentos comercializados apareceram.Brain Research Institute – UCLA. The Confocal Microscope, sem data. Recuperado a 2009, Junho 16, de http://www.gonda.ucla.edu/bri_core/confocal.htm.
Durante os anos 1990, os avanços da óptica e da electrónica ofereceram lasers mais estáveis e mais poderosos de alta eficiência. Além disso, iniciava-se a sintetização de fluorocromos que eram mais cuidadosamente combinados às linhas de excitação do laser. Aliado ao rápido avanço da velocidade de processamento dos computadores e ao aumento da disponibilidade tecnológica de armazenamento de grande volume, emergente no final dos anos 1990, a etapa foi definida como uma explosão virtual, no que diz respeito ao número de aplicações que poderão ser alvo da Microscopia Confocal.