ChIP-seq, ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento, é uma técnica usada para investigar de forma ampla proteínas de ligação ao DNA, modificações de histonas ou nucleossomos . Este método permite identificar locais de ligação proteína-DNA in vivo em escala genômica . Ao combinar o ChIP com o sequenciamento de DNA de alto rendimento, identificam-se os sítios de ligação das proteínas associadas à cromatina, fornecendo informações sobre a regulação da transcrição gênica em células eucarióticas e definindo regulons bacterianos .
ChIP-seq tornou-se o principal método para investigar os efeitos dos fatores de transcrição em todo o genoma. É comumente combinado com análise de microarranjos (ChIP) ou sequenciamento de nova geração para traçar a distribuição das proteínas de ligação ao DNA em todo o genoma . A técnica, quando combinada com microarranjos e sequenciamento de segunda geração, é fundamental para responder perguntas sobre os sítios de ligação de proteínas ao longo do genoma .
Usos O principal uso de ChIP-seq é investigar o efeito de fatores de transcrição e outras proteínas de ligação ao DNA para um dado fenótipo. Furey, Terrence S. “ChIP–Seq and beyond: New and Improved Methodologies to Detect and Characterize Protein–DNA Interactions.” Nature Reviews Genetics 13, no. 12 (December 2012): 840–52. https://doi.org/10.1038/nrg3306. Determinar como as proteínas se ligam ao DNA e como suas estruturas regulam a expressão do gene é essencial para a plena compreensão de muitos processos biológicos e estados de doença. Estas informações epigenéticas são complementares para o genótipo e análise de expressão por sequencimanento de RNA. ChIP-seq é uma alternativa para ChIP-chip, que requer uma matriz de hibridação e necessariamente introduz um viés, pois uma matriz é restrito a um número fixo de sondas.
Sítios específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas podem ser isoladas por imunoprecipitação da cromatina. Através de ChIP é produzida uma biblioteca de sítios de DNA alvo ligados a uma proteína de interesse in vivo. Análises do sequenciamento massivamente paralelo são utilizadas em conjunto com bases de dados de genomas completos para analisar o padrão de interação de qualquer proteína com o DNA, Johnson, D. S., A. Mortazavi, R. M. Myers, and B. Wold. “Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.” Science 316, no. 5830 (June 8, 2007): 1497–1502. https://doi.org/10.1126/science.1141319. ou o padrão de qualquer modificação epigenética da cromatina. Isso pode ser aplicado para o conjunto "ChIP'ável" de proteínas e modificações, tais como fatores de transcrição, polimerases e maquinário de transcrição, proteínas estruturais, modificações proteicas, e de modificações do DNA.http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_chip_sequence.pdf
Metodologia direita|miniaturadaimagem|677x677px|workflow do ChIP-seq
Imunoprecipitação cromatina (ChIP) A imunoprecipitação por cromatina é um método utilizado para a acumulação específica de sequências de DNA curtas associadas à proteína de interesse em células vivas células vivas.Kaboord, Barbara, and Maria Perr. “Isolation of Proteins and Protein Complexes by Immunoprecipitation.” Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 424 (2008): 349–64. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-064-9_27. Um procedimento típico inclui as seguintes etapas:
Formação de ligações cruzadas reversíveis entre DNA e proteínas interagindo com ele; Isolamento de DNA e clivagem em fragmentos por ultra-sonografia ou endonucleases; Precipitação por anticorpos específicos contra a proteína de interesse; Destruição de ligações cruzadas entre proteína e DNA, purificação de DNA.
Como resultado, é possível identificar especificamente os fragmentos de DNA com os quais a proteína em estudo estava ligada.
Essa técnica tem várias limitações. Portanto, geralmente para a ChIP, é necessário um número significativo de células (cerca de 10 milhões), o que dificulta a utilização desse método em organismos modelo pequenos e também limita o número de experimentos que podem ser realizados com uma amostra valiosa. Um número de métodos foi desenvolvido para superar esta limitação, por exemplo Nano-ChIP-seq Adli, Mazhar, and Bradley E Bernstein. “Whole-Genome Chromatin Profiling from Limited Numbers of Cells Using Nano-ChIP-Seq.” Nature Protocols 6, no. 10 (October 2011): 1656–68. https://doi.org/10.1038/nprot.2011.402.
Referências
Categoria:Biotecnologia Categoria:DNA Categoria:Técnicas de genômica Categoria:Técnicas em biologia molecular