ligação=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6c/CpG_vs_C-G_bp.svg/300px-CpG_vs_C-G_bp.svg.png|miniaturadaimagem|300x300px| Um sítio CpG, ou seja, a sequência de nucleotídeos "5'-C-fosfato-G-3'", está indicada em uma fita de DNA (em amarelo). Na fita de DNA reversa (em azul), o sítio complementar 5'-CpG-3' é mostrado. Um pareamento de bases CG entre as duas fitas de DNA também é indicado (direita) Os sítios CpG ou sítios CG são regiões do DNA onde um nucleotídeo citosina é seguido por um nucleotídeo guanina na sequência linear de bases ao longo de sua direção 5' → 3'. Os sítios CpG ocorrem com alta frequência em regiões genômicas chamadas ilhas CpG (ou ilhas CG).
As citosinas em dinucleotídeos CpG podem ser metiladas para formar 5-metilcitosinas. As enzimas que adicionam um grupo metil são chamadas de DNA metiltransferases . Nos mamíferos, 70% a 80% das citosinas CpG são metiladas. A metilação da citosina dentro de um gene pode alterar sua expressão, um mecanismo que faz parte de um campo maior da ciência que estuda a regulação do gene que é chamado de epigenética . As citosinas metiladas frequentemente sofrem mutação para timinas .
Em humanos, cerca de 70% dos promotores localizados perto do sítio de início da transcrição de um gene (promotores proximais) contêm uma ilha CpG.
Características CpG
Definição CpG é uma abreviação de 5'—C—fosfato—G—3''', ou seja, citosina e guanina separadas por apenas um grupo fosfato; fosfato liga quaisquer dois nucleosídeos juntos no DNA. A notação CpG é usada para distinguir esta sequência linear de fita simples do pareamento de bases CG de citosina e guanina para sequências de fita dupla. A notação CpG deve, portanto, ser interpretada como a citosina sendo 5 prime da base guanina. CpG não deve ser confundido com GpC, este significando que uma guanina é seguida por uma citosina na direção 5' → 3' de uma sequência de fita simples.
Sub-representação causada pela alta taxa de mutação Os dinucleotídeos CpG têm sido observados há muito tempo com uma frequência muito menor na sequência de genomas de vertebrados do que seria esperado devido ao acaso. Por exemplo, no genoma humano, que tem um conteúdo de 42% de GC, seria esperado que ocorresse, do tempo um par de nucleotídeos consistindo de citosina seguida de guanina. A frequência de dinucleotídeos CpG em genomas humanos é inferior a um quinto da frequência esperada.
Esta sub-representação é uma consequência da alta taxa de mutação de sítios CpG metilados: a desaminação que ocorre espontaneamente de uma citosina metilada resulta em uma timina, e as bases desemparelhadas G:T resultantes são muitas vezes inadequadamente resolvidas para A:T; enquanto a desaminação da citosina não metilada resulta em uma uracila, que como base estranha é rapidamente substituída por uma citosina pelo mecanismo de reparo por excisão de base. A taxa de transição de C para T em sítios CpG metilados é ~10 vezes maior do que em sítios não metilados.
Distribuição genômica + Sítios CpG Sítios GpC428x428px425x425px Distribuição de sítios CpG (esquerda: em vermelho) e sítios GpC (direita: em verde) no gene APRT humano. CpG são mais abundantes na região a montante do gene, onde formam uma ilha CpG, enquanto GpC são distribuídos de forma mais uniforme. Os 5 exons do gene APRT são indicados (azul), e os códons de início (ATG) e de parada (TGA) são enfatizados (negrito azul). Os dinucleotídeos CpG ocorrem frequentemente em ilhas CpG (veja a definição de ilhas CpG abaixo). Existem 28.890 ilhas CpG no genoma humano (50.267 se incluirmos ilhas CpG em sequências repetidas). Isso está de acordo com as 28.519 ilhas CpG encontradas por Venter et al. uma vez que a sequência do genoma estudada por Venter et al. não incluiu os interiores de elementos repetitivos altamente semelhantes e as regiões de repetição extremamente densas próximas aos centrômeros. Como as ilhas CpG contêm múltiplas sequências de dinucleotídeos CpG, parece haver mais de 20 milhões de dinucleotídeos CpG no genoma humano.
Ilhas CpG ligação=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/5b/Cytosine_becomes_thymine.png/350px-Cytosine_becomes_thymine.png|direita|miniaturadaimagem|350x350px| Como a metilação de sítios CpG seguida de desaminação espontânea leva à falta de sítios CpG no DNA metilado. Como resultado, ilhas CpG residuais são criadas em áreas onde a metilação é rara e os locais CpG permanecem (ou onde a mutação C para T é altamente prejudicial). As ilhas CpG (ou ilhas CG) são regiões com alta frequência de sítios CpG. Embora as definições objetivas para ilhas CpG sejam limitadas, a definição formal usual é uma região com pelo menos 200 pb, uma porcentagem de GC maior que 50% e uma razão CpG observada-esperada maior que 60%. A "razão CpG observada para o esperado" pode ser derivada onde o observado é calculado como: e o esperado como ou .
Muitos genes em genomas de mamíferos têm ilhas CpG associadas ao início do gene (regiões promotoras). Por isso, a presença de uma ilha CpG é utilizada para auxiliar na predição e anotação de genes.
Em genomas de mamíferos, as ilhas CpG são tipicamente de 300 a 3.000 pares de bases de comprimento e foram encontradas em aproximadamente 40% dos promotores de genes de mamíferos. Mais de 60% dos genes humanos e quase todos os genes de manutenção têm seus promotores incorporados em ilhas CpG. Dada a frequência das sequências de dois nucleotídeos do GC, o número de dinucleotídeos CpG é muito menor do que seria esperado.
Um estudo de 2002 revisou as regras de previsão de ilhas CpG para excluir outras sequências genômicas ricas em GC, como repetições Alu . Com base em uma extensa pesquisa nas sequências completas dos cromossomos humanos 21 e 22, as regiões de DNA maiores que 500 bp foram encontradas com maior probabilidade de serem as "verdadeiras" ilhas CpG associadas às regiões 5' dos genes se tivessem um conteúdo de GC maior que 55%, e uma razão CpG observada-esperada de 65%.
As ilhas CpG são caracterizadas por um conteúdo de dinucleotídeo CpG de pelo menos 60% do que seria estatisticamente esperado (~4-6%), enquanto o resto do genoma tem uma frequência CpG muito menor (~1%), um fenômeno chamado supressão de CG. Ao contrário dos sítios CpG na região codificadora de um gene, na maioria dos casos os sítios CpG nas ilhas CpG de promotores não são metilados se os genes forem expressos. Esta observação levou à especulação de que a metilação de sítios CpG no promotor de um gene pode inibir a expressão do gene. A metilação, juntamente com a modificação de histonas, é fundamental para a impressão genômica. A maioria das diferenças de metilação entre tecidos, ou entre amostras normais e de câncer, ocorre a uma curta distância das ilhas CpG (nas "costa da ilha CpG"), e não nas próprias ilhas.
As ilhas CpG ocorrem tipicamente no local de início da transcrição de genes, particularmente genes de manutenção, em vertebrados. A base C (citosina) seguida imediatamente por uma base G (guanina), um CpG, é raro no DNA de vertebrados porque as citosinas em tal arranjo tendem a ser metiladas. Essa metilação ajuda a distinguir a fita de DNA recém-sintetizada da fita-mãe, o que auxilia nos estágios finais da revisão do DNA após a duplicação. No entanto, com o tempo, as citosinas metiladas tendem a se transformar em timinas devido à desaminação espontânea. Existe uma enzima especial em humanos (Timina-DNA glicosilase, ou TDG) que substitui especificamente T's de incompatibilidades T/G. No entanto, devido à raridade dos CpGs, teoriza-se que seja insuficientemente eficaz na prevenção de uma mutação possivelmente rápida dos dinucleotídeos. A existência de ilhas CpG geralmente é explicada pela existência de forças seletivas para teores relativamente altos de CpG, ou baixos níveis de metilação nessa área genômica, talvez tendo a ver com a regulação da expressão gênica. Um estudo de 2011 mostrou que a maioria das ilhas CpG são resultado de forças não seletivas.
Metilação, silenciamento, câncer e envelhecimento ligação=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f6/Cpg_island_evolution.svg/500px-Cpg_island_evolution.svg.png|miniaturadaimagem|500x500px| Uma imagem mostrando um mecanismo evolutivo hipotético por trás da formação da ilha CpG.
Ilhas CpG em promotores Em humanos, cerca de 70% dos promotores localizados perto do sítio de início da transcrição de um gene (promotores proximais) contêm uma ilha CpG.
Os elementos promotores distais também contêm frequentemente ilhas CpG. Um exemplo é o gene de reparo de DNA ERCC1, onde o elemento contendo a ilha CpG está localizado cerca de 5.400 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição do gene ERCC1. As ilhas CpG também ocorrem com frequência em promotores de RNAs não codificantes funcionais, como microRNAs.
Metilação de ilhas CpG silencia genes de forma estável Em humanos, a metilação do DNA ocorre na posição 5 do anel pirimidina dos resíduos de citosina dentro dos sítios CpG para formar 5-metilcitosinas. A presença de múltiplos sítios CpG metilados em ilhas CpG de promotores causa silenciamento estável de genes. O silenciamento de um gene pode ser iniciado por outros mecanismos, mas isso geralmente é seguido pela metilação de sítios CpG na ilha CpG do promotor para causar o silenciamento estável do gene.
Hiper/hipometilação do promotor CpG no câncer Em cânceres, a perda de expressão de genes ocorre cerca de 10 vezes mais frequentemente por hipermetilação de ilhas CpG promotoras do que por mutações. Por exemplo, em um câncer colorretal, geralmente há cerca de 3 a 6 mutações de motorista e 33 a 66 mutações de carona ou passageiro. Em contraste, em um estudo de tumores de cólon em comparação com a mucosa colônica adjacente de aparência normal, 1.734 ilhas CpG foram fortemente metiladas em tumores, enquanto essas ilhas CpG não foram metiladas na mucosa adjacente. Metade das ilhas CpG estavam em promotores de genes codificadores de proteínas anotados, sugerindo que cerca de 867 genes em um tumor de cólon perderam expressão devido à metilação da ilha CpG. Um estudo separado encontrou uma média de 1.549 regiões diferencialmente metiladas (hipermetiladas ou hipometiladas) nos genomas de seis cânceres de cólon (em comparação com a mucosa adjacente), das quais 629 estavam em regiões promotoras conhecidas de genes. Um terceiro estudo encontrou mais de 2.000 genes metilados diferencialmente entre cânceres de cólon e mucosa adjacente. Usando a análise de enriquecimento do conjunto de genes, 569 dos 938 conjuntos de genes foram hipermetilados e 369 foram hipometilados em cânceres. A hipometilação de ilhas CpG em promotores resulta em superexpressão dos genes ou conjuntos de genes afetados.
Um estudo de 2012 listou 147 genes específicos com promotores hipermetilados associados ao câncer de cólon, juntamente com a frequência com que essas hipermetilações foram encontradas em cânceres de cólon. Pelo menos 10 desses genes tinham promotores hipermetilados em quase 100% dos cânceres de cólon. Eles também indicaram 11 microRNAs cujos promotores foram hipermetilados em cânceres de cólon em frequências entre 50% e 100% dos cânceres. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos que emparelham com sequências em RNAs mensageiros para direcionar a repressão pós-transcricional. Em média, cada microRNA reprime várias centenas de genes-alvo. Assim, os microRNAs com promotores hipermetilados podem permitir a superexpressão de centenas a milhares de genes em um câncer.
A informação acima mostra que, em cânceres, a hiper/hipometilação do promotor CpG de genes e de microRNAs causa perda de expressão (ou, às vezes, expressão aumentada) de muito mais genes do que a mutação.
Genes de reparo de DNA com promotores hiper/hipometilados em cânceres