O sequenciamento completo de genoma (SCG) (eu inglês: whole genome sequencing - WGS), também conhecido como sequenciamento de genoma completo, sequenciamento total do genoma, ou sequenciamento do genoma inteiro, é o processo de determinar a totalidade, ou quase a totalidade, da sequência de DNA do genoma de um organismo em um único momento. Isso implica o sequenciamento de todo o DNA cromossômico de um organismo, bem como do DNA contido nas mitocôndrias e, no caso das plantas, no cloroplasto.
O sequenciamento completo do genoma tem sido amplamente usado como ferramenta de pesquisa, mas foi introduzido na clínica em 2014. No futuro da medicina personalizada, os dados da sequência do genoma completo podem ser uma ferramenta importante para orientar a intervenção terapêutica. A ferramenta de sequenciamento de genes no nível de polimorfismo de nucleotídeo único (single-nucleotide polymorphism - SNP) também é usada para identificar variantes funcionais de estudos de associação e melhorar o conhecimento disponível para pesquisadores interessados em biologia evolutiva e, portanto, pode estabelecer a base para prever a suscetibilidade a doenças e a resposta a medicamentos.
O SGC não deve ser confundido com a impressão genética, que determina apenas a probabilidade de que o material genético tenha vindo de um determinado indivíduo ou grupo e não contém informações adicionais sobre relações genéticas, origem ou suscetibilidade a doenças específicas.Kijk magazine, 01 de janeiro de 2009 Além disso, o sequenciamento completo do genoma não deve ser confundido com métodos que sequenciam subconjuntos específicos do genoma - tais métodos incluem o sequenciamento completo do exoma (SCE, 1-2% do genoma) ou a genotipagem de SNP (< 0,1% do genoma).
Histórico
Os métodos de sequenciamento de DNA usados nas décadas de 1970 e 1980 eram manuais; por exemplo, o sequenciamento Maxam-Gilbert e o sequenciamento Sanger. Vários bacteriófagos inteiros e genomas virais de animais foram sequenciados por essas técnicas, mas a mudança para métodos de sequenciamento mais rápidos e automatizados na década de 1990 facilitou o sequenciamento de genomas bacterianos e eucarióticos maiores.
O primeiro vírus a ter seu genoma completo sequenciado foi o bacteriófago MS2, em 1976. Em 1992, o cromossomo III de uma levedura foi o primeiro cromossomo de qualquer organismo a ser totalmente sequenciado. O primeiro organismo cujo genoma completo foi totalmente sequenciado foi o Haemophilus influenzae, em 1995. Depois dele, os genomas de outras bactérias e de algumas arqueas foram sequenciados pela primeira vez, em grande parte devido ao tamanho pequeno do genoma. O H. influenzae tem um genoma de 1.830.140 pares de bases de DNA. Em contraste, os eucariotos, tanto unicelulares quanto multicelulares, como a Amoeba dubia e os seres humanos (Homo sapiens), respectivamente, têm genomas muito maiores (paradoxo do valor C). A A. dubia tem um genoma de 700 bilhões de pares de nucleotídeos espalhados por milhares de cromossomos. Os seres humanos contêm menos pares de nucleotídeos (cerca de 3,2 bilhões em cada célula germinativa; observe que o tamanho exato do genoma humano ainda está sendo revisado) do que a A. dubia, no entanto, o tamanho do genoma deles supera em muito o tamanho do genoma de bactérias individuais.
Os primeiros genomas bacterianos e arqueanos, inclusive o do H. influenzae, foram sequenciados pelo sequenciamento Shotgun. Em 1996, o primeiro genoma eucariótico (Saccharomyces cerevisiae) foi sequenciado. S. cerevisiae, um organismo modelo na biologia, tem um genoma de apenas cerca de 12 milhões de pares de nucleotídeos, e foi o primeiro eucarioto unicelular a ter seu genoma completo sequenciado. O primeiro eucarioto multicelular, e animal, a ter seu genoma completo sequenciado foi o verme nematoide: Caenorhabditis elegans em 1998. Os genomas eucarióticos são sequenciados por vários métodos, incluindo o sequenciamento Shotgun de fragmentos curtos de DNA e o sequenciamento de clones maiores de DNA de bibliotecas de DNA, como cromossomos artificiais bacterianos (bacterial artificial chromosomes - BAC) e cromossomos artificiais de levedura (yeast artificial chromosomes - YAC).
Em 1999, foi publicada toda a sequência de DNA do cromossomo humano 22, o autossomo humano mais curto. No ano 2000, o segundo genoma animal e o segundo invertebrado (mas o primeiro de inseto) foi sequenciado - o da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster - uma escolha popular de organismo modelo em pesquisa experimental. O primeiro genoma de planta, o do organismo modelo Arabidopsis thaliana, também foi totalmente sequenciado em 2000. Em 2001, foi publicado um rascunho da sequência completa do genoma humano. O genoma do camundongo de laboratório Mus musculus foi concluído em 2002.
Em 2004, o Projeto Genoma Humano publicou uma versão incompleta do genoma humano. Em 2008, um grupo de Leida, na Holanda, relatou o sequenciamento do primeiro genoma humano feminino (Marjolein Kriek).
Atualmente, milhares de genomas foram total ou parcialmente sequenciados.
Detalhes experimentais
Células usadas para sequenciamento Praticamente qualquer amostra biológica que contenha uma cópia completa do DNA, mesmo uma quantidade muito pequena de DNA ou DNA antigo, pode fornecer o material genético necessário para o sequenciamento completo do genoma. Essas amostras podem incluir saliva, células epiteliais, medula óssea, cabelo (desde que o cabelo contenha um folículo piloso), sementes, folhas de plantas ou qualquer outra coisa que tenha células contendo DNA.
A sequência do genoma de uma única célula selecionada de uma população mista de células pode ser determinada usando técnicas de sequenciamento do genoma de uma única célula. Isso tem vantagens importantes na microbiologia ambiental nos casos em que uma única célula de uma determinada espécie de microrganismo pode ser isolada de uma população mista por microscopia com base em suas características morfológicas ou outras características distintivas. Nesses casos, as etapas normalmente necessárias de isolamento e crescimento do organismo em cultura podem ser omitidas, permitindo assim o sequenciamento de um espectro muito maior de genomas de organismos.
O sequenciamento do genoma de uma única célula está sendo testado como um método de diagnóstico genético pré-implantação, em que uma célula do embrião criado por fertilização in vitro é coletada e analisada antes da transferência do embrião para o útero. Após a implantação, o DNA fetal sem células pode ser coletado por simples punção venosa da mãe e usado para o sequenciamento do genoma completo do feto.
Técnicas iniciais
O sequenciamento de quase todo o genoma humano foi realizado pela primeira vez em 2000, em parte por meio do uso da tecnologia de sequenciamento Shotgun. Embora o sequenciamento Shotgun do genoma completo para genomas pequenos (4.000 a 7.000 pares de bases) já estivesse em uso em 1979, uma aplicação mais ampla se beneficiou do sequenciamento final em pares, conhecido popularmente como sequenciamento Shotgun double-barrel. À medida que os projetos de sequenciamento começaram a assumir genomas mais longos e complicados, vários grupos começaram a perceber que informações úteis poderiam ser obtidas com o sequenciamento de ambas as extremidades de um fragmento de DNA. Embora o sequenciamento de ambas as extremidades do mesmo fragmento e a manutenção do controle dos dados emparelhados fossem mais complicados do que o sequenciamento de uma única extremidade de dois fragmentos distintos, o conhecimento de que as duas sequências estavam orientadas em direções opostas e tinham aproximadamente o comprimento de um fragmento de diferença entre si era valioso para a reconstrução da sequência do fragmento-alvo original.
A primeira descrição publicada do uso de extremidades emparelhadas foi em 1990, como parte do sequenciamento do locus HPRT humano, embora o uso de extremidades emparelhadas tenha se limitado a fechar lacunas após a aplicação de uma abordagem tradicional de sequenciamento Shotgun. A primeira descrição teórica de uma estratégia pura de sequenciamento de extremidades em pares, pressupondo fragmentos de comprimento constante, foi feita em 1991. Em 1995, foi introduzida a inovação do uso de fragmentos de tamanhos variados, e foi demonstrado que uma estratégia pura de sequenciamento de extremidades em pares seria possível em alvos grandes. A estratégia foi posteriormente adotada pelo Instituto de Pesquisa Genômica (The Institute for Genomic Research - TIGR) para sequenciar todo o genoma da bactéria H. influenzae em 1995, e depois pela Celera Genomics para sequenciar todo o genoma da mosca-das-frutas em 2000, e, posteriormente, todo o genoma humano. A Applied Biosystems, agora chamada Life Technologies, fabricou os sequenciadores capilares automatizados utilizados pela Celera Genomics e pelo Projeto Genoma Humano.
Técnicas atuais
Embora o sequenciamento capilar tenha sido a primeira abordagem a sequenciar com sucesso um genoma humano quase completo, ele ainda é muito caro e leva muito tempo para fins comerciais. Desde 2005, o sequenciamento capilar tem sido progressivamente substituído por tecnologias de sequenciamento de alto rendimento (de "próxima geração"), como o sequenciamento com corante Illumina, o pirosequenciamento e o sequenciamento SMRT. Todas essas tecnologias continuam a empregar a estratégia básica de Shotgun, ou seja, paralelização e geração de modelos por meio da fragmentação do genoma.
Outras tecnologias surgiram, inclusive a tecnologia Nanopore. Embora a precisão do sequenciamento da tecnologia Nanopore seja menor do que as anteriores, seu comprimento de leitura é, em média, muito maior. Essa geração de leituras longas é valiosa, especialmente em aplicações de sequenciamento de novo de genoma completo.
Análise Em princípio, o sequenciamento completo do genoma pode fornecer a sequência bruta de nucleotídeos do DNA de um organismo individual em um único momento. No entanto, uma análise mais aprofundada deve ser realizada para fornecer o significado biológico ou médico dessa sequência, por exemplo, como esse conhecimento pode ser usado para ajudar a prevenir doenças. Os métodos de análise de dados de sequenciamento estão sendo desenvolvidos e refinados.
Como o sequenciamento gera muitos dados (por exemplo, há aproximadamente seis bilhões de pares de bases em cada genoma diploide humano), seu resultado é armazenado eletronicamente e requer uma grande capacidade de computação e armazenamento.
Embora a análise dos dados WGS possa ser lenta, é possível acelerar essa etapa com o uso de hardware dedicado.
Comercialização
Várias empresas públicas e privadas estão competindo para desenvolver uma plataforma de sequenciamento de genoma completo que seja comercialmente robusta para pesquisa e uso clínico, incluindo Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Helicos Biosciences, GE Global Research (General Electric), Affymetrix, IBM, Intelligent Bio-Systems, Life Technologies, Oxford Nanopore Technologies, e o Instituto de Genômica de Pequim. Essas empresas são fortemente financiadas e apoiadas por investidores de capital de risco, fundo de cobertura e bancos de investimento.
Uma meta comercial comumente referenciada para o custo de sequenciamento até o final da década de 2010 era de US$ 1.000; no entanto, as empresas privadas estão trabalhando para atingir uma nova meta de apenas US$ 100.
Incentivos