Дэниель Макгилливрей Браун (англ.: Daniel McGillivray Brown 3 февраля 1923 г., Гиффнок - 24 апреля 2012 г., Кембридж, Великобритания) – британский химик-биоорганик, своими исследованиями заложивший основные представления о структуре РНК и ДНК, внесший значительный вклад в представления о мутагенезе.
Ранние годы Браун вырос в Гиффноке, маленьком городке на южной стороне Глазго. Его предки по отцовской линии прибыли туда в 1844 году и открыли чайную «Дэнни Браун». Отец Брауна, Дэвид, продолжил бизнес, хотя сам надеялся стать инженером, как его отец во время Первой мировой войны. Мать Брауна, Кэтрин, была учительницей. Браун учился в Академии Глазго – платной гимназии, где его учителем химии был А.Дж. Ми, который позже, в 1964 году, написал очень известный учебник «Физическая химия». В сарае, построенном его отцом на заднем дворе дома, он производил опыты, получая хлороформ и газообразный хлористый водород из поваренной соли и концентрированной серной кислоты.С 1941 года учился в Университете Глазго, который закончил с отличием и получил место в Институте Честера Битти, а затем в Хэмпстеде, ЛондонGait Michael J. // Daniel McGillivray Brown. 3 February 1923—24 April 2012 Biogr. Mems Fell. R. Soc.: 66. P. 79–100. 2019. http://doi.org/10.1098/rsbm.2018.0008.
Институт Честера Битти, 1948–1953 годы Должность Браун получил по рекомендации главы химического отдела Глазго Дж. У. Кука. Кук и Э. Л. Кеннауэй вместе с Израэлем Хейглером смогли получить из каменноугольной смолы первый чистый кристаллический бензопирен и другие родственные канцерогены. В это время исследования рака начали получать развитие, появилась концепция о том, что канцерогены в низких концентрациях могут быть ингибиторами опухолей. Синтезы этих соединений были основаны на том факте, что диэтилстилбоэстрол и другие эстрогены считались полезными для лечения больных раком. Задача Брауна заключалась в создании гетероциклических производных стильбена, исследование которых было опубликовано в 1948 году в Journal of the Chemical Society , механизм канцерогенеза в то время активно обсуждался в Институте.
Молодой генетик Энтони Лавлесс излагал свою теорию о том, что канцерогенные алкилирующие агенты являются мутагенами нуклеиновых кислот, которые считались генетическим материалом,что отразилось в книге 1966 года «Генетические и родственные эффекты алкилирующих агентов», в то время как некоторые другие по-прежнему утверждали, что нуклеиновые кислоты не имеют ничего общего с основами генетики и наследственности. Браун заинтересовался предметом нуклеиновых кислот, когда его исследования на степень доктора философии подошли к концу. В дальнейшем Браун был направлен химическом факультете в Кембридже, где Александр Тодд создавал свою лабораторную группу.
Годы работы с Тоддом (1953–1958) и структура РНК В Кембридже Брауна сначала направили в Christ’s колледж , поскольку Браун хотел получить еще одну докторскую степень, так как его не устраивало качество своей квалификации, полученной в Chester Beatty. Компания выпускников и аспирантов, собранная Тоддом, включала большое количество зарубежных аспирантов, что особенно поразило Брауна. Тодд занял кафедру химии в 1944 году, приехав из Манчестера. Он продвинулся в синтезе нуклеозидов со своим основным сотрудником Бэзилом Литгоу . Браун приехал в 1948 году.
Первой работой Брауна с Бэзилом Литгоу был химический синтез некоторых нуклеозидов. Он намеревался окончательно подтвердить химическую структуру фуранозы сахарной части нуклеозидов в природных нуклеиновых кислотах, о которой только на этом этапе можно было догадаться. Очень скоро Браун и Бэзил доказали, что действительно все четыре компонента 2 -деоксинуклеозида ДНК были устойчивы к окислению периодатом натрия, тем самым доказав их химическую структуру фуранозы, а не пиранозы, для которой потребовались бы две соседние гидроксильные группы, что было опубликовано в Journal of the Chemical Society в 1950 г Brown, D. M., & Lythgoe, B. (1950). 406. Deoxyribonucleosides and related compounds. Part II. A proof of the furanose structure of the natural 2-deoxyribonucleosides. Journal of the Chemical Society (Resumed), 1990. Brown, D. M., & Todd, A. R. (1952). 12. Nucleotides. Part IX. The synthesis of adenylic acids a and b from 5′-trityl adenosine. J. Chem. Soc., 0(0), 44–51. doi:10.1039/JR9520000044.
Следующая работа Брауна привела к химическим структурам РНК и, соответственно, ДНК. Эта работа началась с селективного фосфорилирования нуклеозидов с образованием нуклеотидов. Хотя работа Левена и Харриса в 1932 г. по гидролизу РНК позволила предположить, что межнуклеотидная связь образовалась через 3’-гидроксильное положение сахара, но все еще оставались неопределенности, потому что ферменты, используемые в этой области, не обладали достаточной степенью очистки и сильно разлагались. В 1948 году, было показано, что на самом деле не один, а два нуклеотида (а и b) для каждого основания образуются гидролитически и во всех случаях изомеры a были 2’-фосфатами, а изомеры b были 3’ -фосфатами . В кислых условиях изомеры взаимно превращались через 2’,3’-циклический фосфат, что в дальнейшем проверялось путем их синтеза.
Эта работа была представлена Тоддом на конференции Американского химического общества летом 1951 года, где обсуждались последствия для 3’–5’ (или 2’–5’) межнуклеотидных связей в РНК и ДНК (5). Окончательно 3'-5' связь междунуклеотидами была доказана ферментативно с помощью рибонуклеазы А (РНКазы А) при действии на гомополимеры нуклеотидов - в результате получались 2’-3’ -циклические фосфаты. Позже было показано , что только 3’- эфиры (а не 2’-эфиры) гидролизуются нуклеазными ферментами.
Работая в это время с Мелом Фридом, Браун провел по предложению Тодда несколько экспериментов . Много лет спустя, в 1970-х, эти результаты легли в основу некоторых методов секвенирования РНК.
Структура ДНК Работа над структурой РНК имела, конечно же, глубокие последствия и для соответствующей структуры ДНК. Браун и другие члены группы Тодда имели тесное общение с Фрэнсисом Криком и Джимом Уотсоном и, таким образом, держали их в курсе событий в области химической структуры РНК. Работа Брауна, вместе с Майкельсоном, Декером и другими по циклонуклеозидам привела к выводу, что ДНК, как и РНК, содержит 3'-5' связи. Уотсон и Крик начали действовать, обнаружив на основании наблюдений Чаргаффа, что пары оснований A: T и G: C точно таким же образом соединяются с сахарным остовом, что привело к предложению о двойной спиральной структуре. ДНК.
Браун вместе с Тоддом написал более 20 научных статей, прежде чем он стал независимым ученым в химической лаборатории университета Ленсфилд-Роуд.
Химический факультет университета. Работа над фосфоинозитидами. Браун руководил небольшой группой в группе Тодда с 1951 года, но только в 1959 году он стал преподавателем на химическом факультете. В 1957 году его интересы переместились к фосфоинозитидам. Как позже заявил Браун, «их химия была по сути хаосом».
Самым простым случаем было определение химической структуры монофосфоинозитидов . Конкретный вопрос разногласий заключался в том, в каком положении на сахаре был присоединен глицерилфосфат. В 1961 году Браун, работая с Брайаном Кларком и Бобом Леттерсом, показал, что в монофосфоинозитиде, выделенном из разных организмов и их органов присоединен глицерилфосфат через положение 1' сахара (8,9). Работая с Джоном Стюартом в 1963 году, было показано, что такое же связывание через положение 1' сахара с глицерилфосфатом происходит и для трифосфоинозитида (10). В 1963 году, Браун также это продемонстрировал путем синтеза и измерения оптической активности аналогичного (+) - транс-2’-гидроксициклогексилфосфата(6).
Особенность химии этих соединений основана на открытии Брауном и Стюартом того факта, что сложный эфир глицерилфосфата можно аккуратно удалить из инозитида (после деацилирования) путем разрыва связи C – C, расположенной межу соседними гидроксильными группами глицерина, с получением соответствующего фосфата гликолевого альдегида.
Работа над инозитидами также привела Брауна к изучению гидролиза сложных эфиров фосфорной кислоты с точки зрения кинетики в различных условиях, а также влияния соседних гидроксильных групп. Фосфодиэфиры, как известно, обычно довольно устойчивы к гидролизу, но участие соседних гидроксильных групп существенно увеличивает скорости расщепления. Таким образом, механизм расщепления был приведен в соответствие, например, с гидролизом простых эфиров ацетата.
Мутагенез нуклеотидов Вскоре Браун вернулся к нуклеиновым кислотам. В 1961 году он заинтересовался действием мутагенов на ДНК в результате посещения лекции Сиднея Бреннера по генетике бактерий. В том же году Freese et al. (1961) показали, что гидроксиламин является мощным мутагеном нереплицирующейся ДНК, атакуя основной цитозин. Питер Шелл и Браун показали правильный механизм через так называемый «бис-аддукт», в конечном итоге приводящий к N4-гидроксицитозину.
От других исследователей, занимающихся генетикой бактериофагов, стало ясно, что природа мутагенного повреждения ДНК представляет собой переход от С к Т. Химия Брауна смогла объяснить это ошибочным спариванием либо бис-аддукта, либо N4-гидроксицитозина с остатками A, и это было подтверждено экспериментально . Дальнейшая работа включала проведение экспериментов с использованием фермента полинуклеотидфосфорилазы для создания РНК-матриц и РНК-полимераз для их транскрипции после мутагенеза под действием гидроксиламина или метоксиамина, а также для подтверждения природы мутации как перехода C в T (U).
Работа с Майком Хьюлинсом в Кембридже показала тесную взаимосвязь между таким переходным мутагенезом и таутомерией мутировавшего основания.
Лаборатория молекулярной биологии MRC (LMB) (1982–2007) После ухода Бэзила Литгоу в 1953 году, Браун стал преподавателем в Королевском колледже. Он продолжал участвовать в студенческой жизни до конца своей жизни. В 1974 году он стал вице-проректором King’s Fellow, пост, который ему очень нравился и который он занимал до 1981 года.
В 1970-е годы Брауна все больше интересовали структурированные РНК, такие как транспортные РНК. Браун со своей лабораторной группой приступили к работе с тРНК Tyr и Lys и их соответствующими кодонами. Особый интерес Брауна вызвала избирательная реакция метоксиамина с определенными остатками в супрессорной тРНК Tyr, которая происходила в 100–1000 раз быстрее, чем для неструктурированной РНК или одноцепочечной ДНК .
Значение этой работы в том, чтобы лучше понять трехмерные структуры тРНК после того, как в 1965 году Роберт Холли и его коллеги получили Нобелевскую премию за открытие ее первичной последовательности и вторичной структуры (клеверный лист). Химические исследования Брауна помогли определить пары оснований и провести сравнения общих конфигураций различных тРНК и, таким образом, химические методы исследования стали особенно полезными для сравнительного структурного анализа.
Дальнейшая работа привела к способу обнаружения РНК с использованием синтетического олигодезоксирибонуклеотида, полученного путем твердофазного синтеза на подложке-носителе в качестве праймера на ДНК фага M13 для обнаружения последовательностей РНК .
Последовательности ДНК, где избыточность генетического кода вызвала необходимость использовать зонды смешанных последовательностей ДНК, часто с высокой множественностью. Браун занялся разработкой новых неприродных оснований, которые могут образовывать вырожденные пары и тем самым уменьшать сложность смесей зондов.
Работая Полом Конгом, Браун разработал и синтезировал бициклический дезоксирибозид, названный dP. При использовании в качестве трифосфатного производного вместо трифосфата dC, аналог dP был включен в растущую олигонуклеотидную цепь благодаря действию фермента ДНК-полимеразы. Позже Пол Конг синтезировал аналогично транс-стабилизированные производные пурина A и G, одно из которых, названное K, оказалось наилучшим .