В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией () принято обозначать как ОТ-ПЦР (). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК).
Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, ) в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени (), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR.
Описание метода Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу: 1. Реакция первой цепочки: Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C. 2. Реакция второй цепочки: После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.
После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.
Применение ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК.
Примером являются РНК-вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ () для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.
Также ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.
См. также Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР в реальном времени
Примечания
Литература
Категория:Методы молекулярной биологии