Альтернати́вный спла́йсинг — вариант сплайсинга матричных РНК (мРНК), при котором в ходе экспрессии гена на основе одного и того же первичного транскрипта (пре-мРНК) происходит образование нескольких зрелых мРНК. Структурные и функциональные различия образовавшихся транскриптов могут быть вызваны как выборочным включением в зрелую мРНК экзонов первичного транскрипта, так и сохранением в ней частей интронов. Наиболее распространённая разновидность альтернативного сплайсинга предусматривает : отдельные экзоны транскрипта при определённых условиях могут быть как включены в зрелую мРНК, так и пропущены.

Белки, получаемые трансляцией таких мРНК, в результате имеют разные аминокислотные последовательности; таким образом, при альтернативном сплайсинге один транскрипт обеспечивает синтез нескольких белков. Широкое распространение такого сплайсинга у эукариот приводит к значительному увеличению разнообразия белков, закодированных в их геномах. Например, организм человека синтезирует не менее чем 100 тысяч различных белков, в то время как число кодирующих их генов примерно 20 тысяч (при этом среди всех генов человека, которые содержат интроны, более 75 % выступают как матрицы для синтеза пре-мРНК, подвергаемых далее альтернативному сплайсингу).

Образование альтернативно сплайсированных мРНК находится под контролем системы транс-действующих белков (), которые связываются с цис-сайтами первичного транскрипта. Среди факторов сплайсинга выделяют активаторы и репрессоры сплайсинга: первые способствуют использованию отдельных его сайтов, а вторые, наоборот, предотвращают их использование. Механизмы альтернативного сплайсинга очень разнообразны, знание «кода сплайсинга» создаёт возможность предсказывать результаты сплайсинга конкретного гена в тех или иных условиях.

Аномалии альтернативного сплайсинга нередко приводят к болезням; немало генетических заболеваний человека вызвано этими аномалиями. Исследователи полагают, что аберрантный сплайсинг может способствовать развитию рака, причём показано, что при различных видах рака гены факторов сплайсинга часто мутируют, приводя к нарушению нормального хода сплайсинга. Установлено также, что аномалии альтернативного сплайсинга вносят вклад в развитие резистентности организма к химиотерапии.

История изучения Впервые альтернативный сплайсинг был описан в 1977 году у аденовирусов. Было установлено, что аденовирус образует пять различных транскриптов в ранней стадии инфекционного цикла, до репликации вирусной ДНК, и ещё один после начала репликации ДНК; при этом образование ранних первичных транскриптов продолжается после начала репликации ДНК. Дополнительный одиночный транскрипт, образуемый на поздних стадиях инфекционного цикла, считывается с 5/6 аденовирусного генома размером 32 килобазы. Поздний транскрипт гораздо длиннее каждого из ранних вирусных транскриптов. Исследователи показали, что первичный транскрипт, образуемый аденовирусом типа 2 на поздних стадиях инфекции, подвергается сплайсингу разными способами, что приводит к образованию мРНК, кодирующих разные вирусные белки. Кроме того, первичный транскрипт содержит множество сайтов полиаденилирования, в результате чего у разных мРНК могут получаться разные 3'-концы.

В 1981 году альтернативный сплайсинг был описан у клеточного эукариотического гена. Было показано, что в клетках млекопитающих такой альтернативный сопровождает образование гормона кальцитонина. Первичный транскрипт гена кальцитонина содержит 6 экзонов; в зрелую мРНК, кодирующую кальцитонин, входят экзоны 1—4, и сигнал полиаденилирования находится в экзоне 4. У другой мРНК, образуемой из того же первичного транскрипта, при сплайсинге экзон 4 пропускается, и зрелая мРНК содержит экзоны 1—3, 5 и 6. Она кодирует белок, известный как (). В начале 1980-х годов был также открыт альтернативный сплайсинг в генах иммуноглобулинов млекопитающих.

Последующие исследования показали, что альтернативный сплайсинг распространён среди всех эукариот. При этом количество изоформ белка, которые могут быть транслированы с одного гена, может быть весьма значительным. Так, подсчитано, что ген плодовой мушки Drosophila melanogaster, известный как , при независимом комбинировании в мРНК всех имеющихся экзонов потенциально может обеспечить синтез 38 016 изоформ.

Модели

Существует пять моделей альтернативного сплайсинга: Пропуск экзона или кассетный экзон. В данном случае любой экзон может быть вырезан или включён в состав зрелой мРНК. Это — наиболее распространённая модель прохождения альтернативного сплайсинга у пре-мРНК млекопитающих, по некоторым подсчётам, более 38 % событий альтернативного сплайсинга у млекопитающих следует данной модели). Взаимоисключающие экзоны. Из двух экзонов в зрелую мРНК включается только один, но не оба (данная модель сложнее остальных, поскольку предусматривает скоординированное протекание, по крайней мере, двух событий альтернативного сплайсинга). Альтернативный донорный сайт. Используется альтернативный 5'-конец интрона (донорный сайт), так что меняется 3'-конец вышестоящего экзона (у млекопитающих данный механизм ответственен примерно за 8 % событий альтернативного сплайсинга). Альтернативный акцепторный сайт. Используется альтернативный 3'-конец интрона (акцепторный сайт), так что меняется 5'-конец нижестоящего экзона (на этой модели основано примерно 18 % событий альтернативного сплайсинга у млекопитающих). Удержание интрона. Последовательность может быть вырезана как интрон или оставлена в зрелой мРНК. Этот способ отличается от пропуска экзона, поскольку сохраняемая последовательность не окружена интронами. Если оставленный интрон попадает в кодирующую область, то он должен кодировать аминокислотную последовательность с такой же рамкой считывания, как и соседние экзоны. Если же он будет иметь другую рамку считывания или содержать стоп-кодон, белок будет нефункциональным. Это — самый редкий механизм альтернативного сплайсинга у млекопитающих (на него приходится примерно 3 % событий АС; в то же время, данный механизм достаточно широко распространён при онкологических заболеваниях, где он служит одним из механизмов инактивации генов-супрессоров опухолей).

Кроме пяти основных моделей альтернативного сплайсинга, известны два способа получения нескольких белков с одного гена в результате использования множественных промоторов и множественных сайтов полиаденилирования. Однако, использование множественных промоторов относится, скорее, к регуляции транскрипции, чем к альтернативному сплайсингу. Начиная транскрипцию с разных точек, можно получить транскрипты с различающимися 5'-концевыми экзонами. С другой стороны, использование множественных сайтов полиаденилирования приводит к образованию разных 3'-концов у созревающих транскриптов. Оба этих механизма в сочетании с пятью моделями сплайсинга обеспечивают разнообразие мРНК, считываемых с одного и того же гена.

Один транскрипт способен подвергаться более чем одному типу альтернативного сплайсинга. Рассмотренные выше модели хорошо описывают базовые механизмы сплайсинга, однако могут не подходить для сложных случаев. Например, на рисунке справа представлены три формы гена гиалуронидазы 3 мыши, полученные в ходе сплайсинга. Сравнение экзонов первой формы (зелёная) и второй (жёлтая) указывает, что интрон был сохранён в конечном транскрипте, а сравнение второй формы с третьей (синяя) показывает пропуск экзона.

Механизм

Общая схема сплайсинга

Пре-мРНК, транскрибируемая с ДНК, содержит как экзоны, так и интроны, причём число и длина интронов, создающих необходимый фон для альтернативного сплайсинга, у различных эукариот существенно варьирует. Так, среднее число интронов, приходящееся на один интрон-содержащий ген, у модельных организмов составляет: у дрозофилы Drosophila melanogaster — 2,5, у нематоды Caenorhabditis elegans — 4,2, у резуховидки Таля Arabidopsis thaliana — 4,8; у млекопитающих оно изменяется от 5,7 до 7,8. В ходе сплайсинга экзоны должны быть оставлены в транскрипте, а интроны удалены. Регуляцию и выбор сайтов сплайсинга обеспечивают транс-действующие белки-активаторы и репрессоры сплайсинга, а также присутствующие в самой пре-мРНК цис-действующие элементы — энхансеры и сайленсеры сплайсинга.

Типичные эукариотические интроны содержат консенсусные последовательности; так, на 5'-конце каждого интрона присутствует динуклеотид GU, рядом с 3'-концом находится «точка ветвления», в которой всегда присутствует нуклеотид А, а расположенные вокруг него последовательности варьируются. У человека консенсусная последовательность вокруг точки ветвления yUnAy. После точки ветвления расположен ряд пиримидинов (), а 3'-конец интрона выглядит как AG.

Сплайсинг пре-мРНК осуществляет РНК-белковый комплекс, известный как сплайсосома. В состав сплайсосомы входят (snRNP), обозначаемые , , , и (рибонуклеотид U3 в сплайсинге мРНК не участвует). Рибонуклеотид U1 связывается с 5'-концевым динуклеотидом GU, а U2, при участии белковых факторов U2AF, связывается с точкой ветвления (на этой стадии комплекс называется сплайсосомный А-комплекс). Во время формирования А-комплекса определяются 5'- и 3'-границы удаляемого интрона, а также концы экзонов, которые должны быть оставлены .

Далее с А-комплексом связывается комплекс U4, U5, U6. После этого U6 замещает U1, а U1 и U4 покидают комплекс. Оставшийся комплекс подвергается двум реакциям переэтерификации. В ходе первой реакции происходит отрезание 5'-конца интрона от вышележащего экзона и его присоединение в точке ветвления к нуклеотиду А с помощью 2',5'-фосфодиэфирной связи, в результате чего интрон принимает форму лассо. Вторая реакция обеспечивает отрезание 3'-конца интрона и соединение двух экзонов фосфодиэфирной связью; при этом интрон высвобождается и разрушается.

Регуляторные элементы и белки

Сплайсинг регулируется транс-действующими белками (активаторами и репрессорами) и соответствующими цис-регуляторными элементами (сайленсерами и энхансерами) на пре-мРНК. Впрочем, имеются данные, что во многих случаях действие фактора сплайсинга зависит от его положения: когда фактор сплайсинга связан с интронным энхансерным элементом, он действует как активатор сплайсинга, а когда связывается с регуляторным сайтом в экзоне, то действует как репрессор. В регуляции сплайсинга принимает также участие вторичная структура пре-мРНК, которая обеспечивает эффективное сближение друг с другом двух регуляторных элементов или маскирует те последовательности, которые могли бы служить местами связывания факторов сплайсинга. Вместе все эти элементы образуют «код сплайсинга», который определяет, как будет проходить сплайсинг в данных клеточных условиях.

Известны два типа цис-активирующих элементов в пре-мРНК, и им соответствуют транс-активирующие РНК-связывающие белки. Сайленсеры сплайсинга — это элементы, с которыми связываются белки-репрессоры сайленсинга, снижая при этом вероятность того, что по соседству будет находиться сайт сплайсинга. Местом размещения сайленсеров сплайсинга могут быть как интроны (интронные сайленсеры сплайсинга, ISS), так и экзоны (экзонные сайленсеры сплайсинга, ESS). Их нуклеотидные последовательности, как и связывающиеся с ними белки, весьма разнообразны. Большинство репрессоров сплайсинга являются (hnRNP) — такими, как и белок, связывающий полипиримидиновый тракт (PTB).

С энхансерами сплайсинга связываются белки-активаторы сплайсинга, увеличивая эффективную вероятность того, что рядом будет находиться сайт сплайсинга. Их местом размещения также могут служить как интроны (интронные энхансеры сплайсинга, ISE), так и экзоны (экзонные энхансеры сплайсинга, ESE). Бо́льшая часть белков, связывающихся с ISE и ESE, относится к семейству белков (регулирующим не только ход альтернативного сплайсинга, но и многие другие клеточные процессы; первый из белков данного семейства, идентифицированный как фактор сплайсинга, был открыт в 1991 году). Эти белки содержат мотивы, распознающие РНК, а также домены, обогащённые аргинином и серином.