Кэп, 5'-кэп (произносится как пять-штрих-кэп), или кэп-структура (от — шапка) — структура на 5'-конце матричных РНК (мРНК) и некоторых других РНК эукариот. Кэп состоит из одного или нескольких модифицированных нуклеотидов и характерен только для транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II. Наличие кэпа — один из признаков, отличающих эукариотические мРНК от прокариотических, которые несут трифосфат на 5'-конце. Это и другие отличия обуславливают существенно более высокую стабильность, особый механизм инициации трансляции и другие особенности жизненного цикла эукариотической мРНК.
Кэп представляет собой модифицированный рибонуклеотид — 7-метилгуанозин, соединённый 5',5'-трифосфатным мостиком с первым нуклеотидным остатком транскрипта. В узком смысле под кэпом понимают именно 7-метилгуанозин. Кроме того, первые два нуклеотида транскрипта могут быть метилированы по 2'-O-положению остатка рибозы. Кэп способствует эффективному процессингу пре-мРНК, экспорту мРНК из ядра, её трансляции и защите от быстрой деградации.
История До 1970-х годов биохимические исследования мРНК проводили в основном на и бактериофагах. К этому времени было установлено, что мРНК кишечной палочки имеют три фосфатные группы на 5'-конце, такое же допущение делалось и относительно эукариотических мРНК. В 1971—1972 годах Кин-Итиро Миура и Аарон Шаткин установили, что РНК реовируса содержат 2'-O-метилгуанозинфосфат. Это было первое свидетельство присутствия нуклеотидов с метильными группами в РНК вирусов эукариот.
Миура продолжил работу в Японии вместе с Ясухиро Фуруити. Последний установил, что для эффективной транскрипции генов вируса цитоплазматического полиэдроза необходимо присутствие в реакционной смеси донора метильных групп (S-аденозилметионина), при этом одна метильная группа входит в состав первого нуклеотида транскрипта, а вторая — в состав неизвестного компонента. Также Фуруити отметил, что 5'-конец таких РНК оказывается защищён от действия щелочной фосфатазы. В том же году было опубликовано ещё несколько статей, описывающих присутствие метилированных нуклеотидов в РНК, выделенных из эукариотических клеток. После обсуждения всех полученных результатов Фриц Роттман выдвинул предположение, что m7GppNp (где N — любой нуклеотид) является структурой, блокирующей 5'-концы всех эукариотических мРНК. Немного позднее Фуруити и Миура уточнили эту структуру и показали наличие в ней не ди-, а трифосфатного мостика. В то же время Вей и Мосс и группа Миуры обнаружили m7GpppGp и m7GpppAp на 5'-концах мРНК .
Вскоре Фуруити, Шаткин и Джеймс Дарнелл с коллегами проанализировали мРНК клеток HeLa и обнаружили, что их 5'-концы защищены такой же структурой, как и вирусные РНК. Дарнелл впервые предложил использовать термин «кэп».
Особый кэп (m2,2,7GpppNp), характерный для малых ядерных РНК, был впервые обнаружен группой Харриса Буша. Однако, как и в случае с обычным кэпом, в первый раз структура была определена неправильно: она содержала дифосфатный мостик вместо трифосфатного.
Ферменты кэпирования были впервые выделены в лаборатории Мосса.
Типы кэп-структуры и их распространённость
У подавляющего большинства эукариот 5'-конец транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, во время транскрипции модифицируется путём присоединения 7-метилгуанозина (см. рисунок). РНК-полимераза II синтезирует все пре-мРНК, некоторые малые ядерные РНК и малые ядрышковые РНК. Вирусы, которые приспособлены к жизни в эукариотических клетках, также могут иметь кэпированные РНК независимо от того, синтезируются ли они РНК-полимеразой II или другим ферментом. В зависимости от систематического положения эукариотического организма и типа РНК первоначальная кэпирующая структура может подвергаться дальнейшим модификациям, главным образом, метилированию.
На 2013 год известны следующие типы кэпа: кэп 0 (m7GpppNp, где N — любой нуклеотид) — это минимальная кэпирующая структура, которая представляет собой 7-метилгуанозин, соединённый 5',5'-трифосфатным мостиком с первым нуклеотидом РНК. Кэп 0 распознаётся фактором инициации трансляции eIF4E. Кэп 0 характерен для РНК растений (а также вирусов растений) и грибов, у животных он встречается редко (например, кэп 0 обнаружен наряду с кэпом 1 и 2 у Drosophila melanogaster); кэп 1 (m7GpppNm2'-Op) отличается от кэпа 0 метилированием первого нуклеотида транскрипта по 2'-O-положению рибозы; кэп 2 (m7GpppNm2'-OpNm2'-Op) отличается от кэпа 0 метилированием первого и второго нуклеотидов транскрипта по 2'-O-положению рибозы. Для РНК животных характерны кэп 1 и кэп 2, соотношение которых в клетке зависит от вида организма. мРНК и, в некоторых случаях, геномные РНК вирусов животных содержат кэп 1 или кэп 2; кэп 4 (m7GpppNm2'-OpNm2'-OpNm2'-OpNm2'-Op) обнаружен у некоторых простейших; 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп (m2,2,7GpppNp) характерен для малых ядерных РНК и служит сигналом к их транспорту и/или удержанию в ядре.
Интересно, что в РНК вирусов животных первым нуклеотидом после 7-метилгуанозина обычно является пурин, который может быть дополнительно метилирован по атомам азотистого основания (например, с образованием N6-метиладенозина). В клеточных же мРНК животных первым нуклеотидом после кэпа может быть любой из четырёх, и он тоже, как правило, дополнительно метилирован. В целом можно сказать, что чем более высоко организован организм, тем больше метильных групп приходится на один его кэп.
Механизм
Ферменты
Кэпирование — первый этап созревания РНК. Кэпирование происходит во время транскрипции в ядре клетки, когда синтезируемый транскрипт достигает длины 25—30 нуклеотидов. Кэпирование осуществляется тремя ферментами: РНК-трифосфатазой, гуанилтрансферазой и гуанил-N7-метилтрансферазой.
РНК-трифосфатаза отщепляет γ-фосфатную группу от 5'-концевого нуклеотида транскрипта. Аминокислотная последовательность РНК-трифосфатаз существенно варьирует среди эукариот, и можно выделить по крайней мере два семейства данных ферментов: РНК-трифосфатазы, зависимые от бивалентных катионов (характерные для простейших, грибов и вирусов эукариот), и РНК-трифосфатазы, независимые от бивалентных катионов (характерные для животных и растений).
У пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) РНК-трифосфатаза кодируется собственным геном Cet1, в то время как у млекопитающих и других многоклеточных синтезируется бифункциональный фермент, который обладает и РНК-трифосфатазной (N-концевой домен), и гуанилтрансферазной активностью (C-концевой домен). Гуанилтрансфераза (у дрожжей кодируется геном Ceg1) осуществляет перенос остатка ГМФ из ГТФ на β-фосфатную группу 5'-концевого нуклеотида транскрипта с формированием структуры GpppN. Эта реакция происходит в два этапа с образованием промежуточного соединения фермент-(лизил-N)-ГМФ. Гуанилтрансфераза может использовать только 5'-дифосфат в качестве субстрата, что гарантирует кэпирование только 5'-концов первичных транскриптов, но не тех, что сформировались в результате эндонуклеолитического процессинга РНК (отщепления 5'-концевых фрагментов РНК под действием эндонуклеаз). Как исключение, у трипаносом и нематод возможно кэпирование мРНК, прошедших эндонуклеолитический процессинг. Короткие лидерные кэпированные РНК сшиваются с 5'-концом такой мРНК. Однако и в этом случае лидерные РНК подвергаются кэпировани в процессе транскрипции.
N7-метилтрансфераза (или 7-метилтрансфераза) у всех организмов кодируется отдельным геном (Abd1 у дрожжей). Этот фермент катализирует перенос метильной группы от S-аденозилметионина на Gppp-РНК с образованием m7Gppp-РНК.
Связь с транскрипцией
Кэпирование в процессе транскрипции обеспечивается тем, что соответствующие ферменты напрямую связываются с фосфорилированным C-концевым доменом большой субъединицы РНК-полимеразы II. С-концевой домен имеет уникальную эволюционно консервативную структуру: он состоит из многократно повторяющихся аминокислотных мотивов Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser.
Несколько протеинкиназ могут фосфорилировать аминокислотные остатки в C-концевом домене. Переход от инициации транскрипции к ранней элонгации сопровождается фосфорилированием Ser-5 фактором транскрипции TFIIH. В ходе транскрипции количество фосфорилированного Ser-5 снижается, и начинает преобладать фосфорилированный Ser-2. После фосфорилирования РНК-полимеразы II по Ser-5 к транскрипционному комплексу присоединяется негативный транскрипционный фактор DSIF (), который в свою очередь привлекает второй негативный регулятор — NELF (). Вместе эти факторы временно ингибируют дальнейшее прохождение транскрипции.
Гуанилтрансферазный домен кэпирующего фермента млекопитающих имеет сродство к С-концевому домену РНК-полимеразы II, фосфорилированному по Ser-5. У дрожжей с РНК-полимеразой связывается гуанилтрансфераза Ceg1, которая затем привлекает в комплекс РНК-трифосфатазу Cet1. Кроме того, гуанилтрансфераза связывается одновременно и с одной из субъединиц фактора DSIF. Связывание с фосфорилированной формой РНК-полимеразы и с DSIF стимулирует каталитическую активность гуанилтрансферазы.
Описанные взаимодействия обеспечивают прохождение кэпирования вскоре после инициации транскрипции и до того, как транскрипционный комплекс перейдёт к продуктивной элонгации. Считается, что фосфорилированный Ser-5 пропадает к тому моменту, как транскрипт достигает длины 500 нуклеотидов. К этому же времени из транскрипционного комплекса диссоциируют и кэпирующие ферменты. Важно отметить, что не только транскрипция определяет ход кэпирования, но и успешность процесса кэпирования оказывает влияние на дальнейший ход транскрипции (см. ниже).
Функции Кэпирование 5'-конца РНК-транскрипта во многом определяет его дальнейшую судьбу в клетке. Известны следующие функции кэпа: регуляция транскрипции; участие в сплайсинге; участие в процессинге 3'-конца мРНК; регуляция транспорта РНК между ядром и цитоплазмой; защита транскрипта от деградации под действием экзонуклеаз; стимуляция трансляции.
Регуляция транскрипции Ряд исследований указывает на то, что кэпирующие ферменты могут играть роль в регуляции транскрипции. В 2007 году было показано, что промоторы многих генов эукариот постоянно содержат полностью собранный инициаторный комплекс, который может синтезировать короткие транскрипты, однако дальнейшее продвижение этого комплекса внутрь гена, то есть переход от инициации к элонгации транскрипции, подавлено. Предполагают, что такая система позволяет при необходимости быстро начать транскрипцию, что особенно важно в случае генов, отвечающих за эмбриональное развитие и ответ клетки на внешние воздействия. Механизм переключения транскрипции с «паузы» на продуктивную элонгацию в настоящее время рассматривают как ключевой способ контроля за транскрипцией. Есть основания полагать, что кэпирование может быть одним из таких «переключателей».