Флуоресценция нашла широкое применение в различных прикладных биологических и биомедицинских исследованияхJoseph R. Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy. — Springer Science+Business Media, 2006. — ISBN 978-0-387-31278-1. Это физическое явление, суть которого заключается в кратковременном поглощении кванта света флюорофором (веществом, способным флуоресцировать) с последующей быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, отличные от исходногоBernard Valeur Molecular Fluorescence Principles and Applications. — Wiley-VCH Verlag GmbH. — ISBN 3-527-29919-X. Много направлений в биофизике, молекулярной и клеточной биологии возникли и развиваются именно благодаря внедрению новых методов, базирующихся на флуоресценции. Стоит отметить несколько примеров.
Для биофизиков флуоресценция стала быстрым и чувствительным методом исследования структуры, динамики и функций биологических макромолекул — нуклеиновых кислотMillar, David P Fluorescence studies of DNA and RNA structure and dynamics // Current Opinion in Structural Biology 6 (1996) С. 322—326. DOI:10.1016/S0959-440X(96)80050-9. и белковRoyer, C. A. Probing Protein Folding and Conformational Transitions with Fluorescence // Chemical Reviews 106 (2006) (5) С. 1769—1784. DOI:10.1021/cr0404390..
Метод секвенирования ДНК благодаря работам Сэнгера был значительно усовершенствован во второй половине 1980-х годов именно благодаря внедрению флуоресцентной детекции. Важным следствием этого стала высокая скорость и надёжность секвенирования. Кроме того, метод был автоматизированSmith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R., Heiner, C., Kent, S. B. H., & Hood, L. E. (1986). Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 321(6071), 674—679.Prober, J. M., Trainor, G. L., Dam, R. J., Hobbs, F. W., Robertson, C. W., Zagursky, R. J., Cocuzza, A. J., Jensen, M. A., & Baumeister, K. (1987). A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238(4825), 336—341.. Это открыло техническую возможность проведения широкомасштабного (по масштабам того времени) секвенирования и позволило начать проект «Геном человека» в начале 1990-х годов. Хотя секвенирование по Сэнгеру почти полностью вышло из использования, флуоресценция продолжает использоваться в методах секвенирования ДНК следующих поколенийShendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10), 1135—1145.McGinn, S., & Gut, I. G. (2012). DNA sequencing — spanning the generations. New Biotechnology..
Флуоресценция дала новый толчок развитию клеточной биологии. Благодаря конфокальной флуоресцентной микроскопии и разработке новых флуоресцентных меток на базе зелёного флуоресцентного белка (ЗФБ) и его аналогов появилась возможность получать специфически контрастную окраску и делать фотоснимки с высоким разрешением многих внутриклеточных белковых структур. Разработка новых флуоресцентных зондов — веществ, изменяющих флуоресценцию, когда к ним присоединяется определённая молекула — дала возможность детально исследовать химический состав живых клеток и даже организмов, а также его изменение во времени и пространстве, что положило начало флуоресцентному молекулярному имиджингу ()Schepartz, A.; Gonzalez, R. L. Molecular imaging: sine labore nihil // Current Opinion in Chemical Biology 15 (2011) С. 749—751. DOI:10.1016/j.cbpa.2011.11.001.Drummen, G. P. C. Fluorescent Probes and Fluorescence (Microscopy) Techniques — Illuminating Biological and Biomedical Research // Molecules 17 (2012) С. 14067-14090. DOI:10.3390/molecules171214067.
Физические основы флуоресценции Флуоресценция — это одно из явлений, которые могут происходить во время взаимодействия электромагнитного излучения с веществом.
При нормальных условиях подавляющее большинство молекул находится в основном электронном состоянии. Молекулы могут поглощать кванты электромагнитного излучения определённой энергии и переходить в возбуждённое состояние. Это соответствует переходу одного электрона с высшей занятой на самую низкую свободную молекулярную орбиталь. Согласно их мультиплетности, основное и возбуждённое электронные состояния обозначают и . Возбуждение большинства флюорофоров () происходит под действием коротковолнового ультрафиолетового (длина волны 300—400 нм) или видимого (длина волны 400—800 нм) света. После перехода флюорофора в возбуждённое состояние происходит релаксация — процесс, при котором молекула теряет часть энергии; при этом она опускается до самого низкого колебательного подуровня электронного уровня . В жидкой среде при нормальных условиях этот процесс происходит за время порядка нескольких пикосекунд (10−12 с). Согласно правилу Каши именно с самого низкого колебательного подуровня электронного уровня происходит переход в основное электронное состояние, что сопровождается флуоресценцией. Из-за потери энергии во время релаксации и по некоторым другим причинам флуоресцентное излучение имеет меньшую энергию (и соответственно большую длину волны) по сравнению со светом, который поглощается во время возбуждения.
На рисунке, приведённом выше, не показаны другие процессы, которые конкурируют с флуоресценцией. В частности, за время существования молекулы в возбуждённом состоянии может состояться внутренняя конверсия, то есть безызлучательный переход . Существует также возможность перехода молекулы в триплетное состояние за счёт интеркомбинационной конверсии. Полную картину возможных переходов можно увидеть на диаграмме Яблонского. Флуоресценцию не следует путать с другими типами люминесценции, такими как фосфоресценция, хемолюминесценция, биолюминесценция т. п.Alexander P. Demchenko Introduction to Fluorescence Sensing. — Springer Science + Business Media B.V., 2009. — ISBN 978-1-4020-9002-8
Детекция флуоресценции В простейшем случае для наблюдения флюоресценции нужны только раствор флуоресцентного соединения и соответствующий источник света для возбуждения. Удобным источником возбуждения являются ручные ультрафиолетовые лампы.
Основными приборами для изучения флуоресценции в лабораторных условиях являются спектрофлуориметрыUdenfriend, S. Development of the spectrophotofluorometer and its commercialization // Protein Science 4 (1995) (3) С. 542—551. DOI:10.1002/pro.5560040321.. Сильно упрощённая схема такого прибора показана на рисунке. В спектрофлуориметрах используют различные источники света, чаще всего ксеноновые лампы высокого давления. Они дают широкий спектр эмиссии (от ультрафиолетового до инфракрасного света). Излучение от лампы поступает к монохроматору возбуждения, который даёт на выходе свет с определённой нужной длиной волны . После этого монохроматический луч направляется на образец, вызывая его флуоресценцию. Важным является то, что флуоресцентная эмиссия изотропна, то есть её интенсивность одинакова во всех направлениях (не зависит от угла, под которым она наблюдается). Это даёт возможность легко отделить её от возбуждающего света. Расположение детектора под углом 90° к направлению возбуждения даёт возможность улавливать исключительно те фотоны, которые являются результатом флуоресцентной эмиссии. Флуоресцентный свет пропускается сквозь ещё один монохроматор (монохроматор эмиссии, ). После этого интенсивность светового потока измеряется с помощью детектора.
Перечисленные здесь компоненты (источник света, монохроматоры, детектор) в различных вариантах и комбинациях присутствуют во всех приборах, измеряющих флуоресценцию. В зависимости от назначения прибора, конфигурация и характеристики каждого из элементов системы могут варьироваться. Например, вместо монохроматоров могут использоваться наборы светофильтров; в качестве источников монохроматического света могут использоваться лазеры.
Характеристики флуоресцентной эмиссии Существует ряд количественных параметров, описывающих флуоресцентное излучение.
Параметр Обозначение Описание Интенсивность флуоресценции , или Этот параметр пропорционален количеству фотонов, которые достигают детектора в течение единицы времени. Он измеряется в количестве фотонов в секунду (cps, counts per second) либо в относительных единицах (A.U., arbitrary units). Этот параметр зависит как от исследуемого образца, так и от прибора, на котором осуществляют замеры. Спектр флуоресценции Спектр флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны детекции (λem), записанная при устойчивом значении длины волны возбуждения (λex). В простейшем случае зависимость имеет вид асимметричной кривой с одним максимумом. Позиция максимума эмиссии показывает, каким цветом флуоресцирует соединение. Так, максимум флуоресценции при 450 нм примерно соответствует синему свету, максимум при 650 нм означает красную флуоресценцию, и т. д. Ширина спектра флуоресценции органических красителей составляет от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров. Ширина спектра флуоресценции квантовых точек меньше и составляет несколько десятков нанометров. Время жизни флуоресценции Для каждого флуоресцентного соединения можно измерить величину, которая имеет размерность времени и имеет название «время жизни флуоресценции». Это величина порядка наносекунд для большинства флюорофоров. Она показывает усреднённое время существования молекулы в возбуждённом состоянии. Если построить график затухания флуоресценции во времени, он будет иметь вид экспоненциальной кривой. В простейшем случае падение будет моноэкспоненцальным, то есть будет иметь вид прямой в логарифмических координатах.
Время жизни в 1 нс не означает, что флуоресценция образца полностью исчезнет за одну наносекунду. Эта величина означает среднее время существования возбуждённого флюорофора в большой популяции. Флуоресценция, подобно радиоактивному распаду, является стохастическим процессом. То есть, каждая отдельно взятая молекула может излучить фотон за время как более короткое, так и более длинное, чем . Квантовый выход флуоресценции Показывает, какая доля поглощённых фотонов излучается в виде флуоресценции. Как отмечалось выше, флуоресценция конкурирует с рядом других процессов, такими как внутренняя и интеркомбинационная конверсия. Кроме них существует также возможность разрушения флюорофора путём химического превращения (фотообесцвечивания). Вследствие этого количество фотонов, излучаемых вследствие флуоресценции, всегда ниже, чем количество поглощённых фотонов (Ф < 1).
Смежные явления, важные для биологических применений В исследованиях биологических систем полезными являются некоторые явления, связанные с флуоресценцией.
Явление Описание и основные характеристики Анизотропия флуоресценции Показывает, насколько изменяется ориентация возбуждённых молекул за время существования возбуждённого состояния. Для измерения анизотропии флуоресценции необходимы спектрофлуориметры, оборудованные поляризаторами возбуждающего и флуоресцентного света. Зная интенсивность флуоресцентного света, поляризованного в параллельной и перпендикулярной плоскостях, анизотропию можно рассчитать по формуле: