Секвенирование древней ДНК (от «последовательность») — определение нуклеотидной последовательности применительно к молекулам ДНК, извлечённым из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных секвенированием древней ДНК, позволяют установить филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов.
При работе с древней ДНК исследователи сталкиваются со множеством проблем, связанных с сохранностью образцов. ДНК может деградировать с течением времени, химически модифицироваться. Микроорганизмы, участвующие в разложении останков, не только нарушают целостность тканей, но и вносят в образец собственную ДНК, тем самым усложняя процесс выделения древней ДНК и биоинформатического анализа полученных данных. Такие методы, как секвенирование нового поколения и обогащение ДНК-библиотек путём гибридизации позволяют заметно увеличить количество получаемых из образцов информации.
Проведен анализ ДНК ряда древних животных, в том числе мамонта и пещерного медведя. Анализ ДНК из человеческих останков позволил выделить новую группу древних людей — денисовцев, а также выявить детали происхождения современных популяций людей. Ряд открытий был сделан в результате анализа древней ДНК болезнетворных микроорганизмов: произведен анализ генома чумной палочки из лондонских захоронений XIV века и гриба фитофторы из образцов XIX века.
История Исследования древней ДНК начались в 1984 году с секвенирования фрагмента митохондриальной ДНК (мтДНК) вымершей во второй половине XIX квагги, подвида бурчелловой зебры. Было обнаружено, что ДНК не только сохраняется на протяжении более полутора веков, но также может быть частично выделена и секвенирована. Вскоре после этого Сванте Паабо секвенировал образцы, полученные из человеческих мумий. В этих исследованиях ученый использовал бактериальное клонирование для амплификации фрагментов ДНК. Оказалось, что большая часть ДНК в образцах имеет бактериальное или грибное происхождение, а поддающаяся амплификации эндогенная ДНК состоит в основном из коротких повреждённых фрагментов многокопийных локусов (например, мтДНК) и составляет малую часть исследованной ДНК. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило амплифицировать даже немногочисленные сохранившиеся фрагменты ДНК и дало толчок к развитию этой области, однако также увеличило чувствительность результатов к контаминации.
Области применения Исследование древней ДНК имеет важное значение для таких областей науки как генетика, палеозоология, палеоэпидемология, антропология (особенно палеоантропология) и археология. Также эта область стала частью методологии палеогенетики.
Анализ древней ДНК может использоваться для оценки эволюционной близости таксономических групп давно вымерших или сильно изменившихся организмов, конкретные родственные связи которых выяснить иными способами крайне затруднительно. Особое внимание здесь уделяется областям высокой изменчивости — участкам ДНК, где мутации происходят часто. В частности, это короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Анализ митохондриальной ДНК дает более точную информацию в контексте этого метода, так как митохондриальная ДНК имеет гораздо большее количество копий по сравнению с ядерной ДНК (около 1000 копий митохондриальных ДНК и 2 копии ядерной ДНК на клетку).
Анализ древней ДНК также позволяет устанавливать половую принадлежность скелетных останков представителей видов, женские и мужские особи которых отличаются набором половых хромосом, что особенно важно, когда другие методы, например антропометрия, не могут дать точного ответа.
Данный метод находит свое применение и в контексте палеоэпидемологии. Диагностику заболеваний по скелетным останкам и изучение древних пандемий крайне сложно проводить без анализа ДНК возбудителей, сохранившейся в останках больных. Такие исследования стали возможны только в 1990 годах, что позволило прослеживать как эволюцию инфекционных бактериальных штаммов и вирусов, так и их распространение, а также сопоставлять детектируемые по останкам симптомы болезни с современными знаниями о конкретном заболевании.
Технические сложности
Деградация ДНК Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли. Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 пар нуклеотидов, причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования древней ДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам.
При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет.
Примесь чужеродной ДНК Часто вследствие загрязнения, или контаминации, лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК.
Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов. Многие археологические образцы, особенно найденные до появления современных молекулярно-биологических методов, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата.
В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминированияЭтот метод требует наличия референсного генома. В первом приближении метод выглядит следующим образом. Чтения выравниваются на геном, после чего рассматриваются позиции, где встречаются, например, цитозин и тимин. Сравниваются две модели: одна предполагает, что замена цитозина на тимин произошла в результате посмертной деградации ДНК, вторая предполагает, что это полиморфизм или ошибка секвенирования. Модель выбирается по методу максимального правдоподобия.. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации.
Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики.
Методы обработки древней ДНК В качестве источника древней ДНК часто стараются использовать сохранившиеся части тела, не представляющие большого интереса с точки зрения анатомического строения. Из-за описанных выше процессов в большинстве древних образцов содержание интересующей исследователей древней ДНК очень мало — всего около 1 %. Это количество сильно варьирует в зависимости от природы образца. Последние исследования показывают, что значительно больший выход эндогенной ДНК из останков предков человека достигается при выделении материала из зубов и каменистой части височной кости.
Первым шагом является измельчение образца и выделение ДНК. В случае костных остатков используют пескоструйные пистолеты или специализированные дрели для первичной фрагментации. Далее частицы ещё более измельчаются (до порошкообразного состояния) на перемешивающих мельницах. Порошок последовательно обрабатывается набором реагентов и подвергается центрифугированию для очистки ДНК от минералов и прочих примесей.
Следующий этап — изготовление ДНК-библиотек и их обогащение путем гибридизации. Непосредственное получение нуклеотидной последовательности осуществляется путем секвенирования нового поколения.
В 2012 году в статье журнала Methods of Molecular Biology были представлены возможные методы выделения древней ДНК из сохранившихся растительных образцов. Как и в случае с древней ДНК животных, палеорастительные образцы доходят в сохранном виде до нашего времени зачастую из-за охлаждения во время масштабных оледенений.
«Допотопная» ДНК