300п|десно|мини|Брагов закон даје услов који кристална решетка тј. упадно зрачење мора да испуни да би расуто зрачење било у фази, те да би се дифракција могла уочити —- услов позитивне интерференције. У различитим експерименталним техникама варирају се различите величине и на различите начине да би се то остварило, па стога постоји велики број техника рендгенске структурне анализе. За све експерименталне технике потребан је извор рендгенског зрачења, детектор дифрактованих зрака и узорак који се испитује. Просторни распоред дифракционих максимума строго зависи од просторне периодичности атома у кристалу, тј. од изгледа његове кристалне решетке. Добијени резултати се математичким трансформацијама повезују са структуром кристала. Рендгенска структурна анализа (РСА) је техника за испитивање кристалних супстанци, која користи дифракциону слику (дифрактограм) добијену расејавањем рендгенског зрачења (-{X-зрачења}-) на испитиваном кристалу. Основни циљ РСА је одређивање кристалне и молекулске структуре (дужине веза између атома, углови међу везама, апсолутне конформације...) испитиваног узорка.
Рендгенском структурном анализом могуће је одредити структуру великог броја једињења, која се могу наћи у кристалном облику. За сложенија једињења, као што су различити макромолекули (ДНК, протеини) потребно је комбиновати овако добијене резултате са резултатима добијеним другим аналитичким техникама, као што је нуклеарна магнетна резонанција (НМР), и рачунарским симулацијама да би се добила јасна слика о структури датих једињења.
Кристална структура и микроструктура су у уској вези с физичким и хемијским својствима супстанције, па је важност рендгенске структурне анализе велика у низу грана људске делатности. Утолико је рендгенска структурна анализа нашла бројне примене у физици и хемији чврстог стања, хемији, кристалохемији, биохемији, минералогији и биологији, а изузетну примјену има у металургији, керамичкој, фармацеутској и уопште хемијској индустрији.
Историјски подаци
Рендгенски зраци откривени су 1895. године, и име су добили према свом проналазачу, немачком научнику Вилхелму Конраду Рендгену. Прве експерименте са дифракцијом -{X}- зрачења на кристалима спровео је Макс фон Лауе 1911. на кристалима соли. Одмах је уочен огроман потенцијал ове методе за одређивање структуре молекула — до тада доступне само преко хемијских и хидродинамичких експеримената. Пионири у развоју рендгенске структурне анализе били су и Вилијам Браг и Бернал. Први протеин чија кристална структура је решена био је миоглобин једне врсте китова и то радовима Макса Перуца и Џона Кендрјуа (1958), за шта су добили Нобелову награду за хемију.
мини|250п|десно|-{3D}- изглед протеина
Данас је примена РСА у структурној биологији веома распрострањена — према подацима Протеинске банке података () од око 42.000 протеина чија структура је решена, за око 36.000 је заслужна рендгенска структурна анализа (НМР је допринела са око 6.000 решених структура, затим следе електронска микроскопија, -{IC}- спектроскопија...).
Теоријске основе
Основни услов који треба испунити да би дошло до дифракције електромагнетног зрачења јесте да таласна дужина зрачења и димензије решетке буду блиске. То је задовољено јер је таласна дужина -{X}--зрачења 10-9-10-11 -{m}-, што је истог реда величине као и размак суседних равни у кристалу (1-10 Ǻ).
Када рендгенски зраци падну на кристал атоми или јони почињу да делују као нови, секундарни извори зрачења (Хајгенсов принцип), тј. долази до расипања рендгенских зрака на електронским облацима атома. Између расутих зрака долази до интеракције при чему се део таласа појачава, а део слаби или чак поништава и та појава позната је као дифракција.
Постоје два начина објашњавања феномена дифракције, Брагов закон и Лауеови услови за дифракцију, као и приступ преко реципрочне решетке (Евалдова сфера). Резултати су еквивалентни за различите приступе.
Брагов закон
250п|десно|уз Брагов закон Према Браговом тумачењу, дифракција је еквивалентна рефлексији са система паралелних равни у кристалу. Нека монохроматско зрачење пада на кристал (слика испод). Делом се рефлектује са прве равни, а делом са друге.
Услов за конструктивну интерференцију два овако добијена зрака јесте да је њихова путна разлика једнака целобројном умношку таласних дужина (λ) зрачења:
Из овог услова и геометријских односа добија се Брагов закон:
где је -{n}- – цео број, ред дифракције -{d}- – међураванско растојање θ – угао који упадно зрачење заклапа са кристалом
Овај закон намеће тачно одређене услове за θ и λ да би дошло до дифракције рендгенских зрака. Различитим експерименталним техникама ове две величине варирају се на различите начине и тако се стварају услови за појаву дифракције на кристалу. Интензитети дифракционих максимума зависе од врсте атома у кристалној решетки и од њиховог међусобног просторног распореда у складу са захтевима симетрије, тј. зависе од кристалне структуре супстанције.
Евалдова сфера
Евалдова сфера (сфера рефлексије) је конструкција која даје услов за дифракцију у простору реципрочне решетке кристала. Свака тачка реципрочне решетке одговара једној равни (hkl) реалне решетке, па тако и могућој рефлексији са те равни. Таласни вектор упадног и рефлектованог зрачења (куп и креф) су исте дужине, јер се зрачење расејава еластично. Из Браговог закона за реципрочну решетку видимо да је потребан и довољан услов да до дифракције зрачења дође то да тачка реципрочне решетке лежи на Евалдовој сфери полупречника k (таласни број зрачења које се дифрактује). Експериментално се то постиже ротирањем или осциловањем кристала, јер тада за исти угао ротира или осцилује и реципрочна решетка, па ће многе тачке реципрочне решетке проћи кроз сферу рефлексије и у том тренутку појавиће се дифракциони максимуми.
Кристални узорак је по дефиницији периодичне структуре; кристал је изграђен понављањем елементарне ћелије дуж три независна правца. Сваки дифракциони пик одговара рефлексији са једне равни. Како амплитуда рефлектованог зрачења расте линеарно са бројем рефлексија N са исте врсте равни опажени интензитет пикова расте са N2. У периодичним структурама као што је кристална постоји огроман број паралелних равни (еквивалентне у смислу дифракције) што знатно појачава зрачење добијено рефлексијом и издваја га из шума чинећи га мерљивим. Због непостојања такве врсте уређености регистрован интензитет код аморфних тела или течности је знатно мањи. Још битније, у кристалу молекули имају тачно одређену оријентацију због јаких међусобних интеракција док је у аморфним телима или течностима оријентација молекула случајна или се мења са временом па је опажени сигнал у ствари усредњен сигнал по свим могућим оријентацијама молекула у простору чиме се аутоматски губи било каква информација о структури.
Методе дифракције дају корисне резултате само када се примене на кристалне структуре, јер код материјала неуређених структура (аморфни материјали) доћи ће до расејања зрачења под разним угловима, што ће резултирати да интензитет расејаног зрачења буде подједнак у свим тачкама простора а то не даје никакву информацију о датој структури.
Експерименталне методе РСА-е
Принцип извођења РСА-е 300п|десно|мини|Дифрактометар На узорак (монокристал испитиваног једињења) се усмерава сноп x зрачења. У кристалографији се користе рендгенски зраци таласне дужине око 1 Ǻ добијени помоћу рендгенске цеви. Већина метода рендгенске структурне анализе захтева да зрачење буде што ближе монохроматском. У ту сврху испред или иза узорка на пут рендгенског зрачења се поставља монохроматор (кристал кварца, графита..) или код старијих инструмената филтри од танке металне фолије.
Мењањем θ или λ у зависности од технике остварују се услови за добијање дифракционе слике. Дифракциони максимуми се могу детектовати, снимити, помоћу пропорционалног, сцинтилационог бројача или неког другог детектора или на филму. То је дифракциона слика узорка, у којој су похрањене све информације о структурним особинама узорка, о његовој кристалној структури и микроструктури. Те особине могу се сазнати индицирањем дифрактограма, тј. мјерењем положаја дифракционих максимума и анализом расподеле интензитета дуж дифракционе слике.
Савремени уређаји за снимање дифракционих слика су аутоматски дифрактометри за монокристале и поликристале са одговарајућом софтвер подршком, и могућношћу регулисања услова снимања (температура, притисак), слика 5.
Ако се одреде и интензитети зрачења и фазне разлике у односу на упадно зрачење може се, Фуријеовом трансформацијом, како је ниже објашњено, одредити просторна дистрибуција електронских густина:
ρ (x,y,z)= ΣhΣkΣl Fo(h,k,l) exp(iΦhkl) exp(-2πi(hx+ky+lz))
Позната хемијска структура молекула који сачињава кристал омогућава да из мапе електронске густине добијемо модел кристала са одређеним положајем сваког атома, функционалне групе, структуре, у њему.
Испод је дат преглед метода РСА-е и најзначајније примене.
Класификација експерименталних метода
Зависно од врсте узорка и избора експерименталне технике постоје различите методе рендгенске структурне анализе које су приказане у табели 1.
+ Методе РСА Узорак Извор рендгенских зрака Начин бележења рендгенских зрака Лауеова полихроматски филм Ротациона и осцилаторна монокристал монохроматски филм Вајсенбергова монохроматски филм Прецесиона монохроматски филм Дифрактометрија монокристала монохроматски детектор Дебај-Шерерова Прах монохроматски филм (детектор) Гинијеова монохроматски филм Дифрактометрија праха монохроматски детектор
Методе којима се испитује поликристални (прашкасти) узорак првенствено се користе за идентификацију присутних фаза, тј. за квалитативну анализу узорка. Овим методама могу се одредити и прецизни параметри јединичне ћелије, степен кристалинитета узорка, величина кристалита и напони у решетки. Могуће је извести и квантитативну анализу, или пратити фазне трансформације. У новије време дифрактометрија праха се доста користи и за одређивање кристалних структура једињења са вишом симетријом, па чак и за решавање структура свих типва једињења у ab initio поступцима.
Методе којима се испитују монокристали примењују се за одређивање симетрије, просторне групе кристала и за израчунавање параметара решетке. Њихова најзначајнија примена је речавање кристалне структуре једињења.
Одређивање структуре монокристала
Велика примена РСА данас је, као што је већ поменуто, у одређивању структуре протеина и других биомолекула. Овде су описани основни кораци у једној таквој анализи протеина. Примењује се метод дифракције на монокристалу, и као што је горе поменуто користи се монохроматско рендгенско зрачење. Користи се монокристал испитиваног једињења.
Услови кристализације
Стварање кристала довољно квалитетног за дифракцију (довољно правилна структура) је један од главних проблема у експериментима одређивања атомске структуре протеина. До сада је овај процес слабо разјашњен и добијање доброг кристала своди се више на уметност него на науку. Основна идеја је споро, постепено смањење растворљивости молекула, било снижавањем температуре или повећавањем концентрације раствора. Ако се процес изведе брзо или са неравномерном променом ових величина тј. услова кристализације молекули само преципитују формирајући прах на дну суда.