Фаг λ (бактеріофаг λ, коліфаг λ) — помірний бактеріофаг кишкової палички (Escherichia coli). Модельний організм генетики, молекулярної біології та біології бактеріофагів. У життєвому циклі фаг лямбда повинен зробити один великий «вибір» — яким шляхом йому розвиватись: літичним, за якого клітина-живитель програмується на виробництво нових фагових частинок, а згодом гине, вивільняючи в середовище вірусне потомство, чи лізогенний, що полягає у вбудовуванні фагового геному в хромосому бактерії, де він може перебувати тривалий час і передаватись наступним поколінням E. coli. Цей вибір здійснюється на основі відносно простого механізму перемикання генів, що зробило фаг лямбда зручним об'єктом для вивчення регуляції генної експресії. Цей вірус є одним із найбільш детально вивчених живих організмів на Землі.
Як і будь-який помірний бактеріофаг фаг λ здатний до спеціалізованої трансдукції — перенесення генів однієї клітини живителя до іншої. Ця його властивість дозволила використати фаг λ з метою конструювання одних із перших векторних молекул для клонування генів. Їх вдосконалені версії використовуються генетиками і молекулярними біологами і досі.
Історія дослідження
Бактеріофаг λ був відкритий випадково 1951 року Джошуа та Естер Ледербергами під час досліджень кон'югації бактерій E.coli. Штам K12, який вони використовували, містить у своїй ДНК вбудований «дрімаючий» геном фага лямбда. Ледербегри індукували мутагенез у клітинах кишкової палички, для того, щоб отримати ауксотрофних мутантів. Один із одержаних мутантних штамів втратив профаг лямбда, і через це став чутливий до повторної інфекції. Цей штам вирощували разом із іншим ауксотрофним мутантом, щоб з'ясувати, чи можуть вони доповнювати харчові потреби одне одного. Дослідники отримали несподіваний результат: один із штамів (той, що втратив профага) заразився бактеріофагом від іншого і був лізований. Фаг лямбда став важливим об'єктом досліджень, в першу чергу через те, що він паразитує на іншому модельному організмі — кишковій паличці. Вже через кілька років після його відкриття стався справжній «бум» експериментів, у яких використовувався цей організм.
Перші мутанти фага лямбда були отримані Дейлом Кайзером (Dale Kaiser), тоді постдоком Пастерівського інституту, в середині 1950-их років. Це були мутанти, що викликали формування в культурі E.coli «чистих» зон лізису, в той час як фаги дикого типу спричинювали появу зон, які були мутними через розмноження лізогенізованих клітин. Кайзер встановив, що фаги могли втрачати здатність розможуватись лізогенним шляхом, через мутацію в одному із трьох генів, і назвав їх cI, cII та cIII (c від — чистий). В подальших експериментах було з'ясовано, що ген cI відповідав за певну «репресивну сполуку», яка забезпечувала пригнічення профага та імунітет до суперінфекції.
Приблизно через десятиліття Марк Пташне, співробітник Гарвардського університету, виділив цю «репресивну сполуку» і довів, що це білок. Разом із колегами він поставив велику кількість біохімічних експериментів, в ході яких був встановлений механізм взаємодії лямбда-репресора із ДНК. Наступні досліди, проведені в лабораторіях по всьому світу, дозволили з'ясувати механізм «прийняття рішення» бактеріофагом лямбда. Особливої уваги серед них заслуговують досліди Луїса Рейчардта (Louis Reichadrt), аспіранта Дейла Кайзера, який встановив функції білка CII та промотора PRE.
Фаг лямбда був одним із перших вірусів, для геному яких була встановлена повна нуклеотидна послідовність. Секвенування відбувалось під керівництвом Фредеріка Сенґера і завершилось 1982 року.
1986 року вийшло друком перше видання монографії «A Genetic Switch» (Перемикання генів) Марка Пташне, яка вважається класичною працею в галузі досліджень, присвячених регуляції генної активності.A Genetic Switch, Third Edition рецензія на сайті навчальних матеріалів Лабораторії в Колд-Спрінґ-Гарбор
Будова
Віріон фага λ складається із ікосаедричної голівки діаметром близько 50 нм та хвостового відростка довжиною близько 150 нм, на кінці якого розміщені бокові нитки довжиною 85 нм.Information about bacteriophage Lambda на сайті American Society for Microbiology Усього до складу білкової оболонки фага входить близько п'ятнадцяти білків, що кодуються вірусним геномом.
Спадкова інформація представлена двонитковою лінійною ДНК розміром 48502 п.н. з однонитковими взаємнокомплементарними («липкими») кінцями по 12 нуклеотидів. У геномі фага λ виявлено 75 відкритих рамок зчитування.
Життєвий цикл
Фаг лямбда належить до помірних бактеріофагів. На відміну від вірулентних або літичних бактеріофагів, які після інфекції обов'язково перетворюють клітини на «фабрику» продукування нових віріонів, а згодом руйнують її, помірні фаги мають вибір: за сприятливих умов вони розвиваються літичним шляхом, тобто поводять себе схоже до вірулентних, а за нестачі енергетичних ресурсів може реалізуватись інший — лізогенний шлях розвитку, коли фаг перетворюється у латентну «дрімаючу» форму — профаг. За певних умов профаг може активуватись і переходити до літичного розвитку, такий перехід називається індукцією профага.
Під час інфікування кишкової палички бактеріофаг спочатку адсорбується на її поверхні, після чого вводить у цитоплазму свою ДНК. У клітині відбувається експресія невеликої частини вірусних генів, необхідних для прийняття рішення, яким шляхом слід розвиватись. Якщо фаг «вибрав» літичний шлях, більшість його генів активуються, і приблизно за 45 хвилин у бактерії збирається близько 100 нових віріонів, які виходять в середовище руйнуючи клітину живителя.
Натомість під час лізогенного розвитку вірусна ДНК вбудовується у бактерійну хромосому, перетворюючи таку клітину на лізогенну (тобто таку, що за певних умов може стати причиною лізису інших клітин у культурі). Після цього із всього вірусного геному експресується тільки один ген — білка репресора, який пригнічує роботу решти генів. Під час кожного циклу реплікації бактерійної ДНК реплікується і профаг, і кожна дочірна клітина отримує свою копію. У такому стані бактеріофаг лямбда може перебувати необмежений час. Лізогенізація клітини має ще один наслідок: через те, що в її цитоплазмі завжди є певний рівень білка-репресора, вона не може повторно інфікуватись фагом того ж типу.
Спонтанна індукція профага, тобто його перехід до літичного розвитку, є дуже рідкісною подією, і відбувається приблизно в одній із мільйона лізогенних клітин; цим пояснюється низький рівень вірусних частинок у лізогенних культурах. Проте частоту індукції можна підвищити майже до 100% шляхом опромінення бактерій невеликою дозою ультрафіолету. В такому разі в клітинах вмикається SOS-відповідь, покликана забезпечити репарацію пошкоджень ДНК. Білок-репресор реагує на запуск SOS-відповіді в клітині самознищенням, що має наслідком дерепресію інших генів фага, вирізання (ексцизію) його геному із бактерійної хромосоми, та запуск літичного розвитку. З еволюційної точки зору це «розумне» рішення, оскільки SOS-відповідь може означати, що клітина живитель має серйозні неприємності, і краще її покинути.
Літичний розвиток
Адсорбція фага λ на поверхні клітини кишкової палички відбувається завдяки взаємодії білка на кінчику хвостового відростка та поверхневого білка LamB бактерії. Після успішного приєднання фаг вводить свою лінійну ДНК у цитоплазму клітини живителя, де вона замикається у кільце: між комплементарними нуклеотидами «липких кінців» утворюються водневі зв'язки, а однониткові розриви «зашиваються» ДНК-лігазами. Ділянка, що утворюється внаслідок перекривання «липких кінців» називається cos-ділянкою, від англійського cohesive ends.
Експресія ранніх генів Наступною подією в циклі розвитку фага λ є розпізнавання його «ранніх» промоторів PR (правого) та PL (лівого) РНК-полімеразами живителя, які розпочинають транскрипцію. Утворені транскрипти зовсім короткі, оскільки РНК-полімерази, невдовзі по завершенню зчитування одного гена в кожному напрямку натрапляють на термінаторні ділянки (tR і tL), тому на цьому етапі експресуються тільки два так звані передранні або «негайні ранні» гени: N з лівого промотора і cro () — з правого.
Продукт гену N працює як антитермінатор: разом із чотирма бактерійними білками він зв'язується із РНК-полімеразою і модифікує її таким чином, що вона набуває здатності проходити термінаторні ділянки і продовжувати транскрипцію. Модифікуватись може не будь-яка клітинна РНК-полімераза, а тільки та, що зв'язана із спеціальною послідовністю вірусної ДНК — nut (від ). Такі ділянки у геномі фага λ є тільки в двох місцях — перед термінатором tL лівого оперона та перед термінатором tR правого оперона, тому модифікації зазнають саме ті РНК-полімерази, які почали транскрипцію вірусної ДНК. Після цього відбувається експресія всіх генів, що входять до складу ранніх оперонів, найважливішими з них є O та P, які забезпечують реплікацію ДНК.
Спочатку реплікація ДНК відбувається за θ-механізмом (двокерункова реплікація), який забезпечує утворення кільцевих молекул ДНК. Приблизно на 12 хвилину механізм змінюється на «кільце, що котиться», внаслідок чого синтезуються довгі лінійні молекули, що складаються із великої кількості послідовно сполучених копій вірусного геному. Такі молекули називаються конкатамерами і є підходящим субстратом для пакування у фагові голівки.
Експресія пізніх генів Більшість інших білкових продуктів ранніх генів виконують допоміжні функції або беруть участь у виборі літичного або лізогенного шляху розвитку. Один із них необхідний для запуску експресії пізніх генів — білок Q. Схоже до продукту гену N, він виконує роль антитермінатора, хоча біохімічні механізми дії цих білків дещо різні. Пізня транскрипція розпочинається зі промотора PR' пізнього оперона. Цей промотор належить до сильних, тому РНК-полімерази приєднуються до нього відразу після потрапляння вірусної ДНК в клітину, проте транскрипція відразу ж і припиняється, оскільки безпосередньо за PR' міститься термінаторна ділянка. Продукт гену N, не може «розблокувати» транскрипцію в цьому місці, через те, що перед термінатором нема ділянки nut, але наявна послідовність, яка дозволяє білку Q здійснити антитермінацію.
Одночасно внаслідок експресії ранніх генів у клітині накопичується білок Cro. Коли його рівень досягає критичного значення, він блокує подальшу транскрипцію власного та інших ранніх генів, оскільки до того часу їхні продукти вже синтезовані в достатній кількості.
Пізній оперон містить 26 генів: білків, що складають голівку, хвостовий відросток і бокові нитки віріона, а також ферменти, необхідні для лізису бактерії. Голівки і хвостики збираються окремо в цитоплазмі клітини-живителя. У кожну голівку запаковується по одній копії вірусного геному, які відрізаються від конкатамеру в ділянці cos, внаслідок чого формуються «липкі кінці». Після цього голівки та хвостики з'єднуються, формуючи зрілі інфекційні вірусні частинки, що накопичуються у цитоплазмі. Паралельно в бактерії синтезується білок ендолізин (продукт гену R) та голін (продукт гену S), коли рівень останнього достатньо піднімається, він формує у мембрані клітини пори, що дозволяють ендолізину вийти у периплазматичний простір. Там цей фермент проявляє свою активність і розщеплює муреїн клітинної стінки кишкової палички. Позбавлена опори клітинної стінки бактерія розривається від осмотичного шоку, а вірусні частинки виходять у середовище, готові інфікувати нові клітини.
Вибір між літичним та лізогенним шляхом