iTRAQ () — це негелевий метод, що застосовується для кількісного визначення протеїнів, ізольованих з різного біологічного матеріалу в одному експерименті.
Загальна характеристика В основі iTRAQ лежить застосування ізотоп-кодуючих ковалентних зв'язків. Даний метод застосовується в протеоміці для вивчення та визначення кількісних змін протеому.
Процедура
Принцип iTRAQ базується на встановленні мітки, що має ковалентний зв'язок з N-кінцем та боковим ланцюгом амінів пептидів, що сформовані при попередній інкубації перетравлених (часто за допомогою пепсину) екстрактів протеїнів з мітками, що в свою чергу мають різну масу. Існують два типи реагентів iTRAQ: 4-комплексні та 8-комплексні, що можуть бути використані для мічення всіх пептидів з різних біологічних зразків. Після встановлення міток на ці зразки вони змішуються в один пул, після чого їх необхідно фракціонувати, що дозволить проводити подальший аналіз за допомогою рідинної хроматографії тандемної мас-спектрометрії (MS/MS). Отримані фрагментовані дані мас-спектрометрії аналізуються за допомогою пошуку по базі даних пептидів, завдяки чому стає можливим ідентифікація мічених пептидів ти визначення протеїнів, яким ці пептиди відповідають. Кожна мітка iTRAQ генерує іон-репортер з невеликою молекулярною масою, що може бути використаний для відносного підрахунку пептидів та завдяки цьому, опосередковано, дає змогу визначити протеїни, з яких ці пептиді походять.
Оцінка даних
Рівень пептидів Кожен MS/MS-спектр характеризується певним сигналом від іона-репортера iTRAQ, що несе певну цифрову інформацію, яка використовується для обрахунку відносної густини (співвідношення) пептидів, що були ідентифіковані в конкретному спектрі. Густина іонів-репортерів може демонструвати більше ніж один сигнал в даних MS/MS, тому сигнали мають бути інтегровані з спектральної гістограми.
Рівень протеїнів При комбінації даних співвідношення пептидів визначається відносна кількість певного пептиду.
Програмне забезпечення Дані спектрів MS/MS можуть бути проаналізовані за допомогою спеціального програмного забезпечення: i-Tracker jTraqXMuth, T., et al., jTraqX: a Free, Platform Independent Tool for Isobaric Tag Quantitation at the Protein Level, Proteomics, 2010, 10(6): 1223–1225,
Посилання