ДНК-вакцина (також генна вакцина, вакцина на основі нуклеїнових кислот) — генно-інженерна конструкція, яка після введення в клітину забезпечує продукування білків патогенів або пухлинних антигенів та викликає імунну реакцію. Введення ДНК-вакцин в організм називають генетичною імунізацією. ДНК-вакцинація має низку переваг у порівнянні зі звичайними вакцинами. Зокрема показано, що такі вакцини забезпечують не лише вироблення антитіл (гуморальний імунітет), а й специфічну цитотоксичну відповідь (клітинний імунітет), що раніше було досяжним лише з допомогою живих вакцин. Сьогодні ДНК-вакцини не застосовують для лікування людини, проте прогнозується, що генетична імунізація допоможе подолати цілий ряд захворювань.
Історія створення Ідея використовувати фрагменти ДНК для вакцинації з'явилася у 50-60-ті роки. Після серії дослідів було з'ясовано, що генетична інформація ДНК зберігає здатність транскрибуватись і транслюватись після перенесення в іншу клітину. Того ж року виявили, введення тваринам геному вірусу поліомієліту стимулює вироблення антитіл. Пізніше активацію гуморального імунітету показали для молекул ДНК, отриманих з неінфекційних агентів. Починаючи з 90-х років наукові лабораторії почали все активніше досліджувати імуностимулюючі властивості ДНК. У 1992 році Танг разом з колегами показав, що ген гормону росту людини, вбудований в плазміду, стабільно експресується в організмі миші, а синтезований гормон розпізнається імунною системою як антиген і стимулює вироблення антитіл. Процес введення плазмідної ДНК для стимуляції гуморального імунітету був названий Тангом «генетична імунізація». Проте вже наступного року інша група вчених заявила, що введення плазміди, кодуючої білки вірусу грипу, викликає як гуморальну, так і клітинну відповідь. Індукування обох гілок імунітету того ж року виявили і для плазміди, що містила гени ВІЛ. З 1995 року почали з'являтися дані, що ДНК-вакцинація здатна активувати імунну систему проти ракових захворювань. Близько 20 років тому відбулися перші клінічні випробування ДНК-вакцин, які насамперед повинні були продемонструвати безпечність нового методу. Пацієнтам вводили гени ВІЛ, вірусу грипу, герпесу, гепатиту B, збудника малярії. Результати всіх тестів виявилися цілком обнадійливими: ДНК-вакцини стабільно експресувались, провокували імунну відповідь та не викликали серйозних побічних ефектів, що стало поштовхом для їх подальшого дослідження.
Конструювання ДНК-вакцини
За структурою ДНК-вакцина — це вбудована у вектор нуклеотидна послідовність, що кодує певний антиген чи антигени. Вектором в генній інженерії називають молекулу нуклеїнової кислоти, яка слугує для доставки генетичного матеріалу до клітини та забезпечує його реплікацію чи експресію. Раніше для транспортування генів в клітину застосовували вектори на основі вірусів: модифікованого (ослабленого) вірусу натуральної віспи, аденовірусів та ретровірусів. Вірусні вектори є достатньо ефективними, проте мають значну ймовірність розвитку побічних ефектів, пов'язану з відносно високою імуногенністю самого вектора. Тому на сьогодні як вектор частіше використовують бактеріальну плазміду — невелику стабільну кільцеву молекулу ДНК, здатну до автономної реплікації. Сама по собі плазміда не викликає потрібної специфічної імунної відповіді, для цього в неї вшивають гени імуногенних білків. Також ДНК-вакцина повинна містити регуляторні послідовності, необхідні для експресії генів в клітинах еукаріот. Готову ДНК-конструкцію доставляють в бактеріальну клітину, де нарощується кількість її копій. Після цього проводять виділення й очищення плазмід, які несуть потрібну вставку.
Дизайн плазмідного вектора Важливим етапом створення ДНК-вакцин є дизайн (конструювання) вектора. Обов'язковими структурами плазмідного вектора є сайти рестрикції, селективний маркер та точка початку реплікації ДНК-вакцини в бактеріальній клітині. Щоби здійснювався синтез антигену, ДНК-вакцина повинна містити промотор і сигнал поліаденілювання. Промотор є важливим фактором ефективності вакцини, оскільки визначає силу імунної відповіді: чим більша експресія гену, що кодує вірусний чи пухлинний антиген, тим сильніша імунна відповідь. Найчастіше використовують промотор вірусу SV40 або цитомегаловірусу (CMV). Для стабілізації мРНК-транскриптів в плазміду вбудовують сигнал поліаденілювання, частіше за все, отриманий з гену гормону росту бика (BGH) або вірусу SV40. Як селективні маркери вибирають бактеріальні гени стійкості до антибіотиків, часто це ген стійкості до канаміцину. При конструюванні ДНК-вакцин найбільш популярною є точка початку реплікації Escherichia coli.
Вибір гену для імунізації Вектор є важливим компонентом ДНК-вакцини, проте її імуногенність визначається саме вставкою — послідовністю ДНК, що кодує антиген. Серед вірусних антигенів для імунізації найкраще підходять білки злиття — це відносно консервативні білки, які забезпечують проникнення вірусу в клітину. Для вакцинації проти грам-позитивних бактерій в плазмідний вектор доцільно вбудовувати гени тих бактеріальних білків, які визначають патогенез захворювання. З-поміж білків грам-негативних бактерій високу імунногеність мають порини. Для терапевтичних протипухлинних ДНК-вакцин використовують білки-маркери ракових клітин.
Способи доставки ДНК-вакцин в клітину Готову вакцину потрібно доставити в організм людини чи тварини, де її точка призначення — антиген-презентуючі клітини (АПК) — макрофаги, дендритні клітини, В-лімфоцити. Тут буде відбуватись синтез і посттрансляційна модифікація антигенну, після чого він буде вбудований в мембрану клітини, щоб привернути увагу імунної системи. Основа проблема полягає в доставці достатньої кількості плазміди в АПК. Методи доставки генетичного матеріалу в клітинну поділяють зазвичай на 2 групи: вірусні і невірусні. Оскільки вірусні вектори мають ряд суттєвих недоліків, в даному розділі представлені лише невірусні методи доставки ДНК-вакцин.
Мікроін'єкція На початку 1990-х для введення ДНК в клітину найбільш поширеним були внутрішньом'язові мікроін'єкції, що зумовлено простотою методу. Для цього ДНК розчиняють у воді або ізотонічному розчині, при потребі додають ад'ювант (речовину, що підсилює імунну відповідь). Далі за допомогою тонкої скляної трубки розчин вводять в м'язову тканину, де роль АПК виконують дендритні клітини. Потрапивши в ядро дендритної клітини вакцина починає експресуватись і відбувається синтез білків-антигенів. За допомогою мікроін'єкцій ДНК також можна вводити підшкірно, в тимус, печінку, пухлинну тканину, проте саме в м'язовій тканині спостерігається найбільш тривала (до року) експресія ДНК-вакцини. Завдяки високій концентрації клітин Лангерганса (підтип дендритних клітин), привабливою мішенню для ДНК-вакцинації є шкіра. Для інтрадермального (підшкірного) введення використовують масив із мікроголок, довжина яких кілька сотень мікрон. Існують різні варіанти інтрадермальної вакцинації. Простіший включає розпушення масивом мікроголок рогового шару шкіри (зовнішній шар шкіри, зазвичай 10-20 мкм), щоби збільшити її проникність для подальшого місцевого введення розчину ДНК. Ефективнішим є використання мікроголок, покритих сухою вакциною, яка розчиняється вже під шкірою. Ефективність цього методу зазвичай низька, оскільки спочатку ДНК потрапляє в міжклітинний простір, а вже потім включається в клітини.
Електропорація
Електропорація — традиційний підхід для доставки ДНК в бактеріальні клітини і культури клітин, який базується на застосуванні електричного імпульсу. Такий імпульс створює пори в клітинній мембрані, що сприяє входженню негативно зарядженої ДНК. Цей спосіб був запозичений для доставки ДНК-вакцини в організм тварин та людини і дозволяє значно підвищити ефективність звичайної ін'єкції. Прилад для електропорації містить джерело електричного струму та одноразову сітку, яка складається з шприца та голок-електродів. Шприц вводить вакцину в м'язову тканину, а електроди створюють електричне поле, яке полегшує входження ДНК в міоцити і дендритні клітини. На сьогодні розроблені пристрої, які дозволяють підвищити ефективність вакцинації у 1000 разів у порівнянні зі звичайною ін'єкцією. Електропорацію можна застосовувати як для внутрішньом'язового, так і для підшкірного введення ДНК-вакцини. Недоліками є незначна болючість в місці ін'єкції, потреба в спеціалізованих пристроях. Замість електричного поля можна використовувати магнітне. Такі пристрої діють по тому ж принципу, проте у цьому разі процедура є повністю безболісною і менш пошкоджує клітини.
Дія електричного поля не лише посилює поглинання ДНК-вакцини клітинами, а й стимулює вироблення імунної відповіді. Застосування електропорації призводить до незначного пошкодження тканини — розвивається локальний запальний процес. Ушкодженні клітини виділяють хемокіни, тому до них направляються макрофаги, лімфоцити та дендритні клітини. Збільшення концентрації імунних клітин у місці введення вакцини підвищує її ефективність.
Сонопорація Сонопорація — метод перенесення чужорідної ДНК в клітини за допомогою ультразвуку. Ультразвук збільшує проникність клітинної мембрани, внаслідок чого екзогенна ДНК легше проникає в клітину. Вперше сонопорація для перенесення генів в клітину була застосована в 1986 році. Цей метод застосовується для введення молекул ДНК в клітини рогівки, мозку, кісткової тканини, нирок, підшлункової залози, ембріональної тканини, скелетних і серцевого м'язів. Відносно інших методів сонопорація є малодослідженою, необхідно ще чимало зусиль, щоб підвищити її ефективність, особливо на рівні цілого організму.
Балістична трансфекція Балістична трансфекція ґрунтується на обстрілюванні (бомбардуванні) органів і тканин мікрочастинками важких металів (золото, вольфрам) діаметром 1-3 мкм покритих молекулами ДНК. Введена таким чином ДНК-вакцина експресується в клітинах-мішенях, а їхні продукти потрапляють у кров. Для надання прискорення частинкам використовуються схожий на стрілецьку зброю пристрій — генний пістолет або генну гармату. Мікрочастинки проходять через клітинні мембрани і переносять генетичну конструкцію безпосередньо у ядро клітини. Глибина проникнення мікрочасток, як правило, невелика — до 1 мм, тому метод застосовують переважно для трансфекції шкіри або прилеглої хрящової тканини. Особливі умови обстрілу дозволяють мікрочастинкам проникати на глибину до 4-5 мм і переносити генні конструкції у волокна поперечно-смугастих м'язів. Зазвичай клітини, що знаходяться безпосередньо по центру пострілу, гинуть, в той час коли в зоні 0,6-1 см від центру знаходяться найбільш вдало протрансформовані клітини. Цю технологію називають також біобалістикою або біолістикою.
Перший генний пістолет був створений групою вчених у період 1983 та 1986 роками з метою трансформації клітин рослин. Це був пістолет, розроблений на основі пристрою, для автоматичного забивання цвяхів. На вольфрамову кулю наносили ДНК з репортерним (маркерним) геном і вистрілювали нею в чашку Петрі. Експресія репортерного гену свідчила про ефективність імунізації. На сьогодні для доставки ДНК використовують частинки з золота чи срібла, так як вони є не токсичними для клітини, на відміну від вольфрамовихKlein, TM et al (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells . Nature 327:70-73.
Під дією високого тиску