Короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами () — це прямі повтори та унікальні послідовності в ДНК бактерій і архей, що розділяють їх, які спільно з асоційованими генами (Cas, ) забезпечують захист клітини від чужорідних генетичних елементів (бактеріофагів, плазмід). CRISPR-касети виявлені в геномах багатьох бактерій і більшості архей. Повтори мають довжину від 24 до 48 пар нуклеотидів; вони мають бівалентну симетрію, але, як правило, не є істинними паліндромами. Повтори розділені варіабельними ділянками ДНК, спейсерами, приблизно однакової довжини. Спейсери відповідають по нуклеотидній послідовності певним фрагментам ДНК чужорідних генетичних елементів (протоспейсерам). У зв'язку з цим було запропоновано і потім показано, що послідовності, що розділяють повтори, походять з послідовностей геномів бактеріофагів і, відповідно, забезпечують захист клітин від інфекцій.
В результаті досліджень механізму дії CRISPR-системи було зроблено припущення, що вона є прокаріотичним аналогом системи РНК-інтерференції еукаріот і забезпечує бактеріям і археям захист від бактеріофагівKira S. Makarova, Yuri I. Wolf and Eugene V. Koonin (2013) Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucl. Acids Res. 41(8): 4360-4377. .
Роль в генетичній регуляції ендогенних бактеріальних генів Патогенні та синантропні бактерії містять велику кількість білка Cas9 (). Було показано, що система CRISPR/Cas може брати активну участь у регуляції ендогенних бактеріальних генів, зокрема, при взаємодії бактерій з еукаріотичним організмом, в якому вони паразитують. Наприклад, білок Cas9 з Francisella novicida використовує унікальну, CRISPR/Cas-асоційовану малу РНК (scaRNA) для пригнічення ендогенного транскрипту мРНК, що кодує бактеріальний ліпопротеїн, що дозволяє їй послабити імунну відповідь хазяїна й підвищити її вірулентністьSampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS.(2013). A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence . Nature; 497(7448), 254—257. ..
Методи генної інженерії, що базуються на системі CRISPR/Cas9 Розроблено методи високовибіркового активування й інгібування генівLei S. Qi, Matthew H. Larson, Luke A. Gilbert, Jennifer A. Doudna, Jonathan S. Weissman, Adam P. Arkin, Wendell A. Lim.(2013) Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell, 152 (5): 1173—1183 , що базуються на системі CRISPR/Cas9 (CRISPR-системі II типу)Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M., and Kim, J.-S (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819—823Hwang, W.Y., Fu, Y., Reyon, D., et al. and Joung, J.K. (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol., Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol., Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., and Doudna, J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00471.001Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., et al. and Church, G.M. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823—826. Wang, H; Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R. (2013) One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153 (4): 910-8. .Houa, Z; Zhangb, Y; Propsona, N; Howdena, S; Chua, L; Sontheimerb, E; and Thomson, J. (2013) Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS. . Основними компонентами CRISPR-системи II типу є CRISPR-касета, на основі якої синтезуються напрямні crРНК (), нуклеаза Cas9 (Csn1) і tracrРНК (), необхідна для процесингу напрямної РНКKarvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, 10(5), 20-19. . Для спрямованого редагування геному еукаріотів використовують Cas9 Streptococcus pyogenes, , Neisseria meningitidisHou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E.,et al. & Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS, 110(39), 15644-15649 Ines Fonfara, Anaïs Le Rhun, Krzysztof Chylinski, Kira Makarova, Anne-Laure Lécrivain, Janek Bzdrenga, Eugene V. Koonin, Emmanuelle Charpentier (2013) Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. , а також Cas9 з Staphylococcus aureus (SaCas9), яка на 25 % менша за розмірами, що дозволяє упаковувати її в аденоасоційований вірус (AAV) для доставки вектора в клітини живого організму, як терапевтичний засіб CRISPR Clears Major Obstacle Impeding Its Therapeutic Use . GEN News HighlightsF. Ann Ran, Le Cong, Winston X. Yan, et al., & Feng Zhang (2015). In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. . Походження ферменту накладає деякі обмеження на вибір ДНК-мішеней: наприклад при використанні Cas9 S. pyogenes, як мішені можна вибирати тільки послідовності, за якими йде 5'-NGG (де N — будь-який нуклеотид). Перед використанням у генетичних конструкціях ген Cas9 потрібно попередньо оптимізувати за використовуваними кодонама відповідно до організму, геном якого передбачається модифікувати.
З метою спрощення маніпуляцій з клонуванням лентивірусних або ретровірусних векторів доставки, crРНК і tracrРНК об'єднують в одну суцільну sgРНК () — так званий «all-in-one CRISPR-Cas9 cloning vector»Malina, A., Mills, J. R., Cencic, R., et al. & Pelletier, J. (2013). Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays. Genes & development, 27(23), 2602—2614. Genes & Dev. . 27:2602-2614 . Це дозволяє полегшити конструювання та клонування серії векторів доставки, що відрізняються тільки по пришитій до tracrRNA ланцюжку «гідРНК» (), яка впізнає комплементарну їй, послідовність ДНК, вибрану в геномі за замовленням дослідникаHeintze, J., Luft, C., & Ketteler, R. (2014).A CRISPR CASe for high-throughput silencing. Frontiers in genetics, 4. 193. .
Розроблена також технологія самоклонувальних CRISPR/Cas9, що дозволяє взагалі обійтися без клонування, а використовувати коротку дволанцюгову ДНК з послідовністю, що кодує бажаний локус і плазміду, несе саморозщеплювальну паліндромну sgРНК. Це дозволяє скоротити час на підготовки експерименту всього до 2-х годин, а його вартість здешевити в шість разівArbab, M., Srinivasan, S., Hashimoto, T., Geijsen, N., & Sherwood, R. I. (2015). Cloning-free CRISPR. Stem cell reports, 5(5), 908—917 .
Модифікація ДНК-зв'язуючого домену Cas9 і його злиття з різними регуляторними доменами дозволяє отримати вибірково напрямні на потрібні ділянки геному за допомогою РНК-гідів штучні фактори транскрипції (crisprTF) і ефекториKearns, N. A., Genga, R. M., Enuameh, M. S.,et al. & Maehr, R. (2014). Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells. Development, 141(1), 219—223. , штучні ендонуклеази рестрикціїJohn P Guilinger, David B Thompson & David R Liu (2014). Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature Biotechnology, Shengdar Q Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, et al., & J Keith Joung (2014). Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology,, репрессори, а також ферменти, що модифікують епігеном, такі як ДНК-метилази, деметилази і гістонацетилтрансферази, що дозволяє вибірково регулювати активність певних генівIsaac B Hilton, Anthony M D'Ippolito, Christopher M Vockley, Pratiksha I. Thakore, Gregory E Crawford, Timothy E Reddy, Charles A Gersbach.(2015). Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology, . Крім того знайдені аналоги Cas9, які здатні розщеплювати замість ДНК молекули РНК, що дозволяє редагувати або вибірково пригнічувати активність мікроРНКMitchell R. O'Connell, Benjamin L. Oakes, Samuel H. Sternberg, Alexandra East-Seletsky, Matias Kaplan, Jennifer A. Doudna. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014; Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S.,et al. & Terns, M. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139(5), 945—956, . Так, наприклад, Cas9 з грамнегативної бактерії Francisella novicida (FnCas9) може бути перепрограмований так щоб спрямувати його на РНК геном вірусу гепатиту C, що призводить до інгібування синтезу вірусного білка в клітиніAryn A. Price, Timothy R. Sampson, Hannah K. Ratner, Arash Grakoui, and David S. Weiss. Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells. PNAS. . На основі цієї системи можна створити сотні засобів для захисту проти різних вірусів.
Метод сайт-селективного редагування геному за допомогою ферменту, що впізнає необхідну послідовність ланцюга ДНК «за наведенням» комплементарного їй РНК «гіду», обіцяє революційні зміни в дослідженнях та лікуванні цілого ряду захворювань, від ракуSidi Chen et al., & Feng Zhang, Phillip A. Sharp (2015). Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis. Cell, і невиліковних вірусних хвороб до спадкових генетичних патологій на кшталт серповидноклітинної анемії і синдрому ДаунаYin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., … & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. . Він дозволив здешевити, спростити і прискорити розробку генномодифікованих мікроорганізмів, рослинWenzhi Jiang, Huanbin Zhou, Honghao Bi, Michael Fromm, Bing Yang, and Donald P. Weeks (2013) Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucl. Acids Res. (2013) 41 (20): e188 Khaoula Belhaj, Angela Chaparro-Garcia, Sophien Kamoun and Vladimir Nekrasov (2013) Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system Plant Methods , 9:39 і домашньої худоби, а також допоможе в розробленні генної терапії спадкових захворювань у людських ембріонівGiedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? Trends in Microbiology, 21(11), 562—567, Uri Ben-David (2013) Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies? Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 . Так, наприклад, технологія, розроблена Editas, дозволяє взяти клітину з тіла живого організму, замінити певні ділянки ДНК, а потім повернути клітину на колишнє місце. Передбачається, що таким чином можна запустити процес лікування деяких типів захворювань.
Методи дослідження, що базуються на системі CRISPR/Cas9 Прикріпивши до білка Cas9, дефектного по екзонуклеазній активності, зелений флуоресцентний білок EGFP, можна отримати інструмент для візуалізації геномних послідовностей в живих клітинах ссавців і візуального визначення довжини теломер хромосоми, а також відстежувати динаміку генних локусів протягом клітинного циклуBaohui Chen, Luke A. Gilbert, Beth A. Cimini, et al. & Lei S. Qi, Bo Huang (December 2013) Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. 155(7), 1479—1491. .
Успішні експерименти Науковцям з Медичної школи Перельмана Університету Пенсильванії та Дитячої лікарні Філадельфії (CHOP) вдалося під час вагітності лабораторної миші відредагувати ген, аби запобігти летальному порушенню обміну речовин у потомства. Дослідники впевнені, що така технологія допоможе боротися із вродженими захворюваннями людини ще до народження.