Реакція Вассермана (, скорочено РВ, ) — серологічна реакція, призначена для діагностики сифілісу. Базується на реакції зв'язування комплементу. У більшості країн реакція Вассермана замінена на комплекс точніших серологічних тестів як то FTA-ABS ().
Етимологія Названа на честь її першовідкривача і розробника Августа фон ВассерманаA. P. von Wassermann, A. Neisser, C. Bruck. Eine serodiagnostische Reaktion bei Syphilis. Deutsche medicinische Wochenschrift, Berlin, 1906, 32: 745—746. . Він описав реакцію 1906 року, через рік після того, як Фріц Шаудін та Еріх Гофман виявили збудник сифілісу. Це модифікація загальної реакції фіксації комплементу, яку розробили Жуль Борде та Октав Жангу у 1901 році. З тих пір до цієї реакції було внесено багато модифікацій, зокрема КаномGilbert R (January 1930). «Standardization of the Wassermann Test: Abstract of Progress Test». Am J Public Health Nations Health. 20 (1): 47–48. doi:10.2105/AJPH.20.1.47. PMC 1555718. PMID 18012919, Колмером, Заксом тощо, але загальні принципи, застосовані Вассерманом, збереглися. Тому термін «реакція Вассермана» застосовується майже до будь-якого серологічного тесту на сифіліс.
Сутність реакції До проби крові або спинномозкової рідини додається антиген — кардіоліпін, який отримують зі скелетних м'язів або серця великої рогатої худоби. Визначається якісно в плюсах («+») реакції від одного плюса («+») — найменша аглютинація, до чотирьох плюсів «++++» — найбільша аглютинація.
Трепонематозний антиген, що використовувався для реакції фіксації комплементу, складався з культури трепонем, суспендованих у 0,3 % сольовому розчині карболу. Були використані такі штами спірохет: S. pallidum Reiter 36, Kroo, Kasan II та Noguchi, а також штам ротових спірохет. Трепонеми вирощували під парафіновим ущільненням у модифікованому середовищі Кро, що складається з 10 % відвару сироватки овець (рН 7,8), містить шматочки їхньої вареної печінки. Для приготування антигену прозора надосадкову рідину повністю вирощених, як правило, 3-4-денних культур, сифонували у великі склянки для центрифуг і центрифугували впродовж 1-2 годин, приблизно на 2500 обертів / хв. Осад тричі промивали стерильною дистильованою водою, а потім суспендували в 0,3 % сольовому розчині карболу. Якщо отриманий розчин не був повністю вільним від зважених частинок, їх видаляли центрифугуванням на низькій швидкості. Для реакції фіксації комплементу з трепонемним антигеном комплемент стандартизували за наявності дози антигену, використаної у власному тесті. Його титр, як правило, був лише трохи нижчим від титру, виявленого в оцінці без антигену, який використовувався для реакції Вассермана. У ній власне 1 об'єм інактивованої сироватки, 5 об. антигену і 5 об. комплементу інкубували впродовж півгодини на водяній бані при 370 ° С, а потім додавали 5 об. сенсибілізованих овечих клітин. Оскільки антиген розбавляли 0 3 % сольовим розчином карболу, сироватковий контроль також проводили за допомогою сольового розчину карболу. Повний гемоліз, який спостерігається в контролі сироватки крові, та відсутність реакції з сифілітичними сироватками карбованих антигенів, приготованих з організмів, відмінних від S. pallidum, доводять, що фенол сам не здатний діяти як антиген у таких концентраціях на результат цієї реакції.
Дослідження показали, що деякі з існуючих штамів S. pallidum (як то Кру чи Рейтер) відрізнялися своєю антигенною структурою, що виявлялося в тестах аглютинації і фіксації комплементу.
Реакція неефективна для виявлення первинного сифілісу, оскільки на цьому етапі організм не створює достатньо антитіл. Реакція не є специфічною тільки для сифілісу і дає хибно позитивні результати при інших хворобах, як то системний червоний вовчак, малярія та туберкульоз.
При сифілісі можливий і негативний результат реакції. Кілька негативних результатів реакцій Вассермана впродовж кількох років після лікування сифілісу свідчать про те, що хворобу виліковано.
Технологічне забезпечення проведення реакції Термостат з температурою 37 °C. Холодильник з температурою 4 °C. Інактиватор (водяна або сухоповітряна лазня) з температурою 56 °C. Центрифуга. Пробірки розміром 14×60 мм, 15×100 мм, 15×150 мм. Піпетки градуйовані 1, 2 мл з рисками на 0,01 мл. Піпетки градуйовані 5, 10 мл з рисками на 0,1 мл. Циліндри мірні місткістю 100, 250, 500, 1000 мл з рисками на 5 мл. Склянки хімічні, ємністю 100, 250, 500 мл.
Кров для проведення реакції беруть натщесерце або не раніше 6 годин після прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною температурою тіла, не раніше 24 годин від вживання спиртних напоїв не раніше 24 годин, у тих, хто переніс недавно інфекційне захворювання, у жінок під час менструації, вагітних в останні 10 днів вагітності, породіль у перші 10 днів після пологів, новонароджених у перші 10 днів життя.
Кров з вени в кількості 7—10 мл беруть у суху чисту пробірку або у вакутайнер. У грудних дітей після 10 днів життя кров беруть з надрізу п'ятки вузьким скальпелем. Кров має бути доставлена не пізніше 48 годин з моменту отримання за умови зберігання в холодильниках при 4 °C. Доставлену в лабораторію кров в день її взяття поміщають до термостату при 37 °C на 15-30 хвилин. Згусток, що утворився, відокремлюють скляною паличкою від стінок пробірки і центрифугують 15 хвилин при швидкості 1000 об / хв. Над згустком утворюється прозора сироватка крові, яка за допомогою піпеток з гумовим балоном без захоплення еритроцитів переноситься у другу пробірку. За наявності все ж таки в сироватці домішок еритроцитів її центрифугують і відділяють від них. Жовтяничні, хільозні, різко гемолізовані та пророслі мікроорганізмовими колоніями сироватки крові для дослідження не придатні.
Реакція Вассермана починаючи з другої половини XX століття ставилася з двома антигенами: трепонемним і Його випускають ліофільно висушеним у флаконах по 5 і 10 мл. Зберігають у холодильнику при 4 °C. Термін придатності вказано на етикетці. Антиген розчиняють і розводять фізіологічним розчином натрію хлориду відповідно об'єму і титру, вказаному на етикетці флакона.
Кардіоліпіновий антиген являє собою очищений від баластних домішок спиртовий екстракт ліпідів з м'язів бичачого серця. Активність антигену обумовлюється присутністю 3-х компонентів — фосфоліпіду, лецитину і холестерину. Зберігається в ампулах при низькій температурі. Перед використанням антиген з ампули переноситься в суху чисту пробірку, яку щільно закривають корковою чи притертою скляною пробкою. У разі випадання кристалів холестерину антиген слід прогріти на водяній бані при 56 °C або в термостаті при 37 °C до повного розчинення кристалів. Для проведення реакції антиген розводять відповідно титру, вказаному на етикетці ампули. Розведений антиген повинен бути злегка опалесціюючим, але не каламутним. Подвійні дози антигенів не повинні демонструвати гемотоксічність (гемоліз у відсутності комплементу), що встановлюється відповідним контролем антигену при титруванні комплементу. Гемолізин — це сироватка крові кролика чи осла, імунізованих еритроцитами барана. Титр гемолітичної сироватки не має бути нижчим 1:1200. Визначення титру проводять так: готують основне розведення 1: 100 (0,1 мл гемолітичної сироватки на 9,9 мл фізіологічного розчину), з якого роблять ряд відповідних розведень.
Згодом у ряд інших пробірок відміряють по 0,5 мл раніше приготовлених розведених гемолітичних сироваток, починаючи з 1:1000, додають по 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію і 0,5 мл комплементу в розведенні 1: 10, а також 0,5 мл 3 % суспензії еритроцитів барана. Пробірки поміщають у термостат при температурі 37 °C на 1 годину, періодично струшуючи їх 2-3 рази.
Титром гемолітичної сироватки вважається найвище її розведення, що дає повне розчинення 0,5 мл 3 % суспензії еритроцитів барана в присутності комплементу. Баран має бути віком 1-5 років. Кров у нього беруть шляхом пункції яремної вени не частіше 1 разу на 10 днів, в кількості не більше 200 мл у суху стерильну банку зі скляними намистинами, яку струшують протягом 5-10 хвилин. Згодом кров фільтрують через подвійний шар марлі та відокремлюють згустки ниток фібрину, що утворилися. У той момент, коли робиться реакція, еритроцити барана 3-5 разів відмиваються фізіологічним розчином шляхом центрифугування, що здійснюють упродовж 10 хвилин при 1,5 тисячах обертів / хвилину. Останню безбарвну порцію промивної рідини зливають, а осад знову центрифугують для того, щоб його ущільнити. Надосадову рідину знову видаляють, а з щільного осаду готують 3 % суспензію еритроцитів барана у 0,9 % розчині натрію хлориду. Відмиті еритроцити в наступні дні в роботі не використовують. За наявності гемолізу еритроцити барана до вживання непридатні. Дефібринована кров зберігається у широкогорлій посудині, накритій стерильно серветкою впродовж 5-7 днів у холодильнику при 4 °C. Перед постановкою реакції при використанні такої крові еритроцити необхідно відмивати фізіологічним розчином.
Як комплемент застосовують суміш сироватки крові, отриманої через пункцію серця у 5-10 здорових морських свинок. Кров для кращого згортання поміщають до термостату при 37 °C упродовж 30 хвилин. Після утворення згустку його відділяють від стінок пробірки, яку поміщають до холодильнику при 4 °C до наступного дня. Отриману прозору сироватку крові зливають і використовують як комплемент. Активність цього комплементу при зберіганні в холодильнику при 4 °C триває впродовж 1-2 діб. При консервуванні сухою борною кислотою і сірчанокислим натрієм комплемент може зберігатися в холодильнику при 4 °C 1-2 місяці. Може бути використаний ліофільно висушений комплемент, що випускається в ампулах по 1 мл. Розчинення сухого комплементу здійснюють у день постановки реакції додаючи 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду легко струшуючи. Необхідну для постановки реакції кількість комплементу утворюють змішуванням вмісту кількох ампул однієї серії. Безпосередньо перед постановкою реакції Вассермана проводиться титрування комплементу в присутності всіх інгредієнтів, що беруть участь. Його титрують обов'язково в чистому вигляді (без антигенів), тобто в присутності тільки гемолітичної системи і також з кожним антигеном, що входять у дослідження. Титрування комплементу проводять також у присутності інактивованої негативної сироватки крові людини. При титруванні інгредієнти розводять наступним чином: Розводять гемолітичну сироватку по потроєному титру у фізіологічному розчині. З щільного осаду еритроцитів виготовляють 3 % суспензію у фізіологічному розчині. Розливають 3 % суспензію еритроцитів барана та ізотонічний розчин у 5 контрольних пробірок, розведену по потроєному титру гемолітичну сироватку в другій контроль. Виготовляють гемолітичну систему, при цьому розчин гемолітичної сироватки, розведеної по потроєному титру, приливають до рівного об'єму 3 % суспензії еритроцитів барана і швидко все змішують шляхом переливання з однієї колби в іншу. Отриману суміш поміщають у термостат при 37 °C на 30 хвилин для сенсибілізації еритроцитів. Розводять антигени фізіологічним розчином за вказівками на етикетці титру. Розводять негативну інактивовану сироватку крові людини в співвідношенні 1:5. Розводять комплемент 1:10.