Metoda Grama – metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.

Została opracowana w 1884 przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–1938).

Schemat barwienia na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę hodowli płynnej lub w przypadku hodowli stałej nanieść 1-2 krople soli fizjologicznej i wykonać rozmaz szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić (dzięki temu procesowi jest łatwiejsze wnikanie barwnika do wnętrza komórki): fizycznie: trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika; chemicznie: poprzez użycie np.: formaliny lub etanolu z domieszką eteru; utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego z dodatkiem 1-2% fenolu odczekać 60 sekund do 3 minut tryskawką delikatnie zmyć barwnik zalać preparat jodyną lub płynem Lugola odczekać 30 sekund do 2 minut ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund spłukać preparat wodą destylowaną dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem

Mechanizm barwienia Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne. Dodatkowy barwnik (np. safranina lub fuksyna) barwi komórki Gram-ujemne na różowo lub czerwono, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być czworakie: bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy, prawie czarny, określa się jako Gram-dodatnie (Gram +) bakterie odbarwiające się pod wpływem etanolu z koloru ciemnofioletowego na kolor różowy, określa się jako Gram-ujemne (Gram −) bakterie niebarwiące się standardową metodą Grama, np. prątki (są trudnobarwliwe – można je wybarwić poprzez wydłużenie czasu dla fioletu krystalicznego i płynu Lugola), bakterie Gram-zmienne, np. Gardnerella vaginalis. Efekt barwienia zależy od podłoża i wieku hodowli: starsze hodowle Clostridium mogą barwić się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie) kiełkujące przetrwalniki (i pierwsze pokolenie po wykiełkowaniu) Bacillus subtilis barwią się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie)

Przypisy

Bibliografia

Kategoria:Barwienia