Początkowo Muzeum Zamkowe dysponowało skromną ilością zbiorów, których rdzeniem były wydobyte z gruzów detale architektoniczne, dzieła rzeźby i rzemiosła artystycznego. W ciągu następnych dekad systematycznie wzbogacano zbiory, co przyniosło efekt w postaci około 40 tysięcy muzealiów, w których oprócz bogatej kolekcji plastyki gotyckiej znalazła się zbrojownia, kolekcja numizmatów czy wyrobów z bursztynu.
Jednocześnie placówka ta stała się ważnym centrum kultury i nauki. Działalność naukową muzeum prowadzi w zakresie archeologii, historii i historii sztuki. Przedmiotem zainteresowań archeologów są pradzieje terenów wokół delty Wisły, badania historyczne oscylują wokół tematyki zakonu krzyżackiego, dziejów miasta Malborka i zamku. Przedmiotem badań historyków sztuki jest nie tylko bogata kolekcja zamkowych muzealiów, ale również sztuka i kultura dawnych Prus i problematyka konserwatorska. Celem działalności kulturalnej Muzeum Zamkowego jest organizowanie wystaw związanych z historią zamku i Krzyżaków, ale także organizacja rozmaitych koncertów, prezentacji, imprez i widowisk plenerowych wykorzystujących gotycką architekturę zamku. Tradycję sięgającą początku lat sześćdziesiątych ubiegłego wieku ma Międzynarodowe Biennale Ekslibrisu Współczesnego.