Sangerovsko sekvenciranje ili Sangerov metod je postupak DNK sekvenciranje koji uključuje elektroforezu i zasniva se na nasumičnoj inkorporaciji didezoksinukleotida koji završavaju lanac putem DNK-polimeraze tokom DNK replikacija in vitro. Nakon što su ga prvi razvili Frederick Sanger i kolege 1977. godine, postao je najčešće korišten metod sekvenciranja otprilike 40 godina. Prvi put ga je komercijalizirao Applied Biosystems 1986. U skorije vrijeme, Sangerovsko sekvenciranje većeg obima zamijenjeno je sekvenciranjem metodima sljedeće generacije, posebno za velike, automatizirane genomske analize. Međutim, Sangerova metod ostaje u širokoj upotrebi za manje projekte i za validaciju rezultata dubokog sekvenciranja. I dalje ima prednost u odnosu na tehnologije sekvenciranja kratkog čitanja (kao što je Illumina), u tome što može proizvesti očitavanje DNK sekvence od > 500 nukleotida i održava vrlo nisku stopu greške sa tačnošću od oko 99,99%. Sangerovo sekvenciranje se još uvijek aktivno koristi u naporima za javnozdravstvene inicijative kao što je sekvenciranje šiljastog proteina iz SARS-CoV-2 kao i za nadzor izbijanja norovirusa kroz CaliciNet mrežu nadzora Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC). thumb|upright=1.75| Sangerov metod (terminacija lanca) za sekvenciranje DNK.

Metod thumb|right| Fluorescentne ddNTP molekule Klasični metod završetka lanca zahtijeva jednolančani DNK šablon, DNK prajmer, DNK-polimerazaDNK-polierfazu, normalne dezoksinukleotidne trifosfate (dNTP-e) i modificirane didezoksinukleotidne trifosfate (ddNTPs), od kojih potonji završavaju produžavanje lanca DNK. Ovim nukleotidima koji završavaju lanac nedostaje 3'-OH grupa potrebna za formiranje fosfodiesteske veze između dva nukleotida, što uzrokuje da DNK-polimeraza prestane sa produžavanjem DNK kada se ugradi modificirani ddNTP. ddNTP-ovi mogu biti radioaktivno ili fluorescentno označeni za detekciju u automatizovanim mašinama za sekvenciranje.

Uzorak DNK je podijeljen u četiri odvojene reakcije sekvenciranja, koje sadrže sva četiri standardna dezoksinukleotida (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i DNK-polimerazu. Svakoj reakciji se dodaje samo jedan od četiri didezoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP ili ddTTP), dok su ostali dodati nukleotidi obični. Koncentracija dezoksinukleotida bi trebala biti približno 100 puta veća od one odgovarajućeg didezoksinukleotida (npr. 0,5 mM dTTP : 0,005 mM ddTTP), kako bi se omogućilo da se proizvede dovoljno fragmenata, dok se još uvijek prepisuje kompletna sekvenca (ali koncentracija ddNTP također ovisi o željenom dužina sekvence). Stavljajući to u razumniji red, četiri odvojene reakcije su potrebne u ovom procesu za testiranje sva četiri ddNTP. Nakon ciklusa produžetka DNK šablona iz vezanog prajmera, rezultujući fragmenti DNK se zagrijavaju denaturiraju i razdvajaju po veličini pomoću gel elektroforeza. U originalnoj publikaciji iz 1977. godine, formiranje petlji uparenih bazama ssDNK bilo je uzrok ozbiljnih poteškoća u rješavanju pojaseva na nekim lokacijama. Ovo se često izvodi pomoću denaturirajućeg poliakrilamidnog-ureja gela pri čemu se svaka od četiri reakcije odvija u jednoj od četiri pojedinačne trake (trake A, T, G, C). DNK trake se tada mogu vizualizirati autoradiografijom ili UV svjetlom, a DNK sekvenca se može direktno očitati sa X-zrakama filma ili slike gela. thumb|right|Dio radioaktivno obilježenog gela za sekvenciranje Na slici desno, rendgenski film je bio izložen gelu, a tamne trake odgovaraju fragmentima DNK različite dužine. Tamna traka u traci ukazuje na fragment DNK koji je rezultat prekida lanca nakon ugradnje didezoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP ili ddTTP). Relativni položaji različitih traka između četiri trake, odozdo prema gore, zatim se koriste za čitanje DNK sekvence.

thumb|left|DNK fragmenti su označeni radioaktivnom ili fluorescentnom oznakom na prajmeru (1), u novom lancu DNK sa obilježenim dNTP, ili sa obilježenim ddNTP. Tehničke varijacije sekvenciranja završetka lanca uključuju označavanje nukleotidima koji sadrže radioaktivni fosfor za radioobilježavanje, ili korištenje prajmera označenog na 5' kraju fluorescentnom bojom. Sekvenciranje prajmera boje olakšava čitanje u optičkom sistemu za bržu i ekonomičniju analizu i automatizaciju. Kasniji razvoj od strane Leroya Hooda i saradnika fluorescentno obilježenih ddNTP i prajmera postavili su scenu za automatizovano, visoko propusno sekvenciranje DNK. thumb|Ljestve sekvence radioaktivnim sekvenciranjem u poređenju sa fluorescentnim pikovima

Metodi prekida lanca uveliko su pojednostavile sekvenciranje DNK. Naprimjer, komercijalno su dostupni kompleti zasnovani na prekidu lanca koji sadrže reagense potrebne za sekvenciranje, prethodno raspoređene u alikvote i spremne za upotrebu. Ograničenja uključuju nespecifično vezivanje prajmera za DNK, što utiče na precizno očitavanje sekvence DNK i sekundarne strukture DNK koje utiču na vijernost sekvence.

Redoslijed boje-terminatora thumb|left| Kapilarna elektroforeza Sekvenciranje terminatora boje koristi označavanje terminatora lanca ddNTP, što omogućava sekvenciranje u jednoj reakciji, a ne u četiri reakcije kao u metodu označenog prajmera. U sekvenciranju terminatora boje, svaki od četiri terminatora didezoksinukleotidnog lanca označen je fluorescentnim bojama, od kojih svaka emituje svjetlost na različitim talasnim dužinama.

Zbog svoje veće ekspeditivnosti i brzine, sekvenciranje dye-terminatora je sada glavni oslonac u automatskom sekvenciranju. Njegova ograničenja uključuju efekte boje zbog razlika u inkorporaciji bojom označenih terminatora lanca u fragment DNK, što rezultira nejednakim visinama vrhova i oblika u tragu hromatograma elektronske DNK sekvence nakon kapilatne elektroforeze (vidi sliku lijevo).

Ovaj problem je riješen korištenjem modificiranih enzimskih sistema DNK-polimeraze i boja koje minimiziraju varijabilnost inkorporacije, kao i metoda za eliminaciju "mrlja boje". Metod sekvenciranja dye-terminatora, zajedno sa automatizovanim analizatorima DNK sekvence velike propusnosti, korišćen je za veliku većinu projekata sekvenciranja sve do uvođenja sljedeće generacije.

Automatizacija i priprema uzoraka thumb|Pogled na početak čitanja prajmera terminatora boje Automatizovani instrumenti za sekvenciranje DNK (DNK sekvenceri) mogu sekvencirati do 384 DNK uzorka u jednoj seriji. Serijski se izvodi do 24 puta dnevno. DNK sekvenceri razdvajaju lance po veličini (ili dužini) pomoću kapilarne elektroforeze, detektuju i snimaju fluorescenciju boje, i izlaze podatke kao fluorescentni pikhromatogramskog traga. Reakcije sekvenciranja (termocikliranje i obilježavanje), čišćenje i resuspenzija uzoraka u pufer rastvoru izvode se odvojeno, prije ubacivanja uzoraka u sekvencer. Brojni komercijalni i nekomercijalni softverski paketi mogu automatski smanjiti tragove DNK lošeg kvaliteta. Ovi programi ocjenjuju kvalitet svakog pika i uklanjaju bazne vrhove niskog kvaliteta (koji se općenito nalaze na krajevima sekvence). Preciznost ovakvih algoritama je lošija od vizuelnog pregleda ljudskog operatera, ali je adekvatna za automatizovanu obradu velikih skupova podataka sekvence.

Primjene sekvenciranja koje završava bojom Područje javnog zdravlja ima mnoge uloge u podršci dijagnostici pacijenata, kao i ekološkom nadzoru potencijalnih toksičnih supstanci i cirkulirajućih bioloških patogena. Laboratorije za javno zdravstvo (PHL) i druge laboratorije širom svijeta odigrale su ključnu ulogu u pružanju brzih podataka o sekvenciranju za praćenje virusa SARS-CoV-2, uzročnika COVID 19, tokom pandemije koja je proglašena vanrednim stanjem za javno zdravlje 30. januara 2020. Laboratorije su dobile zadatak da brzo implementiraju metode sekvenciranja i zatražene su da pruže tačne podatke za pomoć u modelima donošenja odluka za razvoj politika za ublažavanje širenja virusa. Mnoge laboratorije pribjegle su metodologijama sekvenciranja sljedeće generacije, dok su druge podržale napore sa Sangerovskim sekvenciranjem. Napori za sekvencioniranje SARS-CoV-2 su brojni, dok je većina laboratorija implementirala sekvenciranje cijelog genoma virusa, drugi su se odlučili za sekvenciranje vrlo specifičnih gena virusa kao što je S-gen, koji kodira informacije potrebne za proizvodnju šiljastog proteina. Visoka stopa mutacija SARS-CoV-2 dovodi do genetičkih razlika unutar S-gena i ove razlike su imale ulogu u infektivnosti virusa. Sangerovsko sekvenciranje S-gena pruža brz, tačan i pristupačniji metod za pronalaženje genetičkog koda. Laboratorije u zemljama s nižim prihodima možda nemaju mogućnosti za implementaciju skupih aplikacija kao što je sekvenciranje sljedeće generacije, tako da Sangerovi metodi mogu prevladati u podršci generiranju podataka sekvenciranja za nadzor varijanti.

Sangerovsko sekvenciranje je također "zlatni standard" za metode nadzora norovirusa za CaliciNet mreži Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC). CalciNet je mreža za nadzor epidemije koja je uspostavljena u martu 2009. Cilj mreže je prikupiti podatke o sekvenciranju cirkulirajućih norovirusa u Sjedinjenim Državama i aktivirati nizvodno djelovanje kako bi se utvrdio izvor infekcije, i ublažilo se širenje virusa. CalciNet mreža je identifikovala mnoge infekcije kao bolesti koje se prenose hranom. Ovi podaci se zatim mogu objaviti i koristiti za razvoj preporuka za buduće akcije za sprečavanje kvarenja hrane. Metodi koji se koriste za detekciju norovirusa uključuju ciljano pojačavanje specifičnih područja genoma. Amplikoni se zatim sekvenciraju korištenjem Sangerove sekvence koja završava bojom, a generirani hromatogrami i sekvence se analiziraju pomoću softverskog paketa razvijenog u BioNumerics. Prate se sekvence i proučava se povezanost sojeva kako bi se zaključila epidemiološka relevantnost.

Poređenja sa drugim tehnikama sekvenciranja + Vrijednosti performansi za tehnologije sekvenciranja genoma uključujući Sangerove metode i metode sljedeće generacije Tehnologija Broj traka Zapremina injektiranja (nL) Vrijeme analize Prosječna dužina čitanja Propusnost (uključujući analizu; Mb/h) Izlijevanje gela Praćenje trake Gel za ploče 96 500–1000 6–8 sata 700 bp 0,0672 Da Da Elektroforeza kapilarnog niza 96 1–5 1–3 sata 700 bp 0,166 Ne Ne Mikročip 96 0,1–0,5 6–30 minuta 430 bp 0,660 Ne Ne 454/Roche FLX (2008) < 0.001 4 sata 200–300 bp 20–30 Illumina/Solexa (2008) 2–3 days 30–100 bp 20 ABI/SOLiD (2008) 8 dana 35 bp 5–15 Illumina MiSeq (2019) 1–3 dana 2x75–2x300 bp 170–250 Illumina NovaSeq (2019) 1–2 dana 2x50–2x150 bp 22.000–67.000 Ion Torrent Ion 530 (2019) 2.5–4 sata 200–600 bp 110–920 BGI MGISEQ-T7 (2019) 1 day 2x150 bp 250.000 Pacific Biosciences SMRT (2019) 10–20 sati 10–30 kb 1,300 Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 dana 13–20 kb 700

Krajnji cilj visokopropusnog sekvenciranja je razvoj sistema koji su jeftini i izuzetno efikasan u dobijanju produženih (većih) dužina čitanja. Većee dužine čitanja svakog pojedinačnog elektroforetskog odvajanja, značajno smanjuju troškove povezane sa de novo sekvenciranjem DNK i brojem šablona potrebnih za sekvenciranje DNK kontiga u datoj redundansi. Mikrofluidika može omogućiti brže, jeftinije i lakše sklapanje sekvence.

Također pogledajte Sekvencioniranje druge generacije Sekvencioniranje treće generacije

Reference

Dopunska literatura

Vanjski linkovi MBI Says New Tool That Automates Sanger Sample Prep Cuts Reagent and Labor Costs

Kategorija:Metodi sekvenciranja DNK Kategorija:Tehnike molekularne biologije Kategorija:Biotehnologija Kategorija:DNK

de:Sanger-Methode