thumb| Mikrobne kulture na čvrstim i tečnim medijima Mikrobna kultura je metod umnožavanja mikrobnih organizama tako što im se omogućava razmnožavanje u unaprijed određenom mediju za kulturu pod kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Mikrobne kulture su temeljne i osnovni dijagnostički metodi koji se koriste kao istraživački alati u molekulskoj biologiji. Termin "kultura" može se odnositi i na mikroorganizme koji se uzgajaju.
Mikrobne kulture se koriste za određivanje vrste organizma, njegove brojnosti u uzorku koji se testira ili oboje. To je jedna od primarnih dijagnostičkih metoda mikrobiologije i koristi se kao alat za određivanje uzroka zarazne bolesti tako što se omogućava razmnožavanje uzročnika u unaprijed određenom mediju. Na primjer, uzorak iz grla se uzima struganjem tkiva sluznice stražnjeg dijela grla i upijanjem uzorka u medij kako bi se mogli provjeriti štetni mikroorganizmi, kao što je Streptococcus pyogenes, uzročnik streptokokne upale grla. Nadalje, termin kultura se općenito koristi neformalno i odnosi se na "selektivni uzgoj" određene vrste mikroorganizma u laboratoriji.
Često je neophodno izolirati čistu kulturu mikroorganizama. Čista (ili aksenična) kultura je populacija ćelija ili višećelijskih organizama koji rastu u odsustvu drugih vrsta ili tipova. Čista kultura može poticati iz jedne ćelije ili jednog organizma, u kom slučaju su ćelije genetski klonovi jedna druge. Za želiranje mikrobne kulture koristi se medij agaroznog gela (agar). Agar je želatinozna supstanca dobivena iz morskih algi. Jeftina zamjena za agar je guar guma, koja se može koristiti za izolaciju i održavanje termofila.
Historija Prva podloga za kulturu bila je tečna, koju je dizajnirao Louis Pasteur 1860. This was used in the laboratory until Robert Koch's development of solid media in 1881. Kochova metoda korištenja ravne ploče za čvrste medije zamijenjena je okruglom kutijom Juliusa Richarda Petrija 1887. Od ovih temeljnih izuma, razvio se širok spektar medija i metoda koji pomažu naučnicima da uzgajaju, identificiraju i pročišćavaju kulture mikroorganizama.
Tipovi mikrobnih kultura right|thumb|200x200px| Kultura Bacillus anthracis
Prokariotska kultura Uzgoj prokariota obično uključuje bakterije, budući da je arheje teško kultivirati u laboratorijskim uvjetima. Da bi se dobila čista prokariotska kultura, potrebno je započeti kulturu iz jedne ćelije ili jedne kolonije organizama. Budući da je prokariotska kolonija bespolno potomstvo jedne ćelije, sve ćelije su genetički identične i rezultirat će čistom kulturom.
Virusna kultura
Virusne i fagne kulture zahtijevaju ćelije domaćina u kojima se virus ili fag razmnožavaju. Kod bakteriofaga, kulture se uzgajaju inficiranjem bakterijskih ćelija. Fag se zatim može izolovati iz rezultirajućih plakova u bakterijskoj podlozi na ploči. Virusne kulture se dobijaju iz njihovih odgovarajućih eukariotskih ćelija domaćina. Metoda ploče s prugama je način fizičkog odvajanja mikrobne populacije i vrši se širenjem inokulata naprijed-nazad pomoću inokulacijske petlje preko čvrste agarne ploče. Nakon inkubacije, nastat će kolonije i pojedinačne ćelije će biti izolovane iz biomase. Nakon što se mikroorganizam izoluje u čistoj kulturi, potrebno ga je sačuvati u održivom stanju za daljnja proučavanja i upotrebu u kulturama koje se nazivaju matične kulture. Ove kulture moraju se održavati tako da ne dođe do gubitka njihovih bioloških, imunskih i kulturnih karakteristika.
Kultura eukariota
Eukariotske ćelijske kulture pružaju kontrolirano okruženje za proučavanje eukariotskih organizama. Jednoćelijski eukarioti - poput kvasca, algi i protozoa - mogu se uzgajati na slične načine kao i prokariotske kulture. Isto vrijedi i za višećelijske mikroskopske eukariote, kao što je C. elegans.
Iako su makroskopski eukariotski organizmi preveliki za kultivaciju u laboratoriji, ćelije uzete iz ovih organizama mogu se kultivirati. To omogućava istraživačima da proučavaju specifične dijelove i procese makroskopskog eukariota in vitro.
Metodi kultivacije
+Pregled metodaMetodOpisUpotreba i prednostiTečne/bujonske kultureOrganizmi se inokuliraju u tikvicu s tekućim medijimaUzgoj velikih količina organizama, antimikrobni testovi, diferencijacija bakterijaAgarne pločeOrganizmi se postavljaju ili razmazuju na Petrijeve zdjelicePruža čvrstu površinu za stacionarni rast, kompaktne su i mogu se slagati jedna na druguMjerne pločice na bazi agaraU suštini minijaturne agar ploče u obliku mjernih pločicaDijagnostičke svrhe, mogu se koristiti bilo gdje, isplative, jednostavne za korištenjeSelektivni i diferencijalni medijiOrganizmi se kultiviraju u/na specifičnim medijima kako bi se odabrali ili razlikovali određeniPomažu u identifikaciji nepoznatih organizama, pomažu u pročišćavanju kulturaUbodne kultureOrganizmi se inokuliraju u epruvetu s čvrstim agaromKratkoročno skladištenje, diferencijacija bakterija Tečne kulture Jedna metoda mikrobiološke kulture je tečna kultura, u kojoj se željeni organizmi suspenduju u tečnom hranjivom mediju, kao što je Luria bujon, u uspravnoj tikvici. Ovo omogućava da se uzgajaju velike količine bakterija ili drugih mikroorganizama za različite daljnje primjene.
Tečne kulture su idealne za pripremu antimikrobnog testa u kojem se tečni bujon inokulira bakterijama i ostavlja da raste preko noći (može se koristiti "mućkalica" za mehaničko miješanje bujona, kako bi se podstakao ujednačen rast). Nakon toga, uzimaju se alikvoti uzorka za testiranje antimikrobne aktivnosti određenog lijeka ili proteina (antimikrobni peptidi). thumb|Tečne kulture cijanobakterije Synechococcus PCC 7002 Statičke tečne kulture mogu se koristiti kao alternativa. Ove kulture se ne tresu i mikrobima pružaju gradijent kisika.
Agarne ploče thumb| Primjer algoritma obrade moguće bakterijske infekcije u slučajevima bez specifično traženih ciljeva (nebakterije, mikobakterije itd.), s najčešćim situacijama i agensima koji se vide u okruženju Nove Engleske. Sivi okvir blizu gornjeg lijevog ugla prikazuje Vennov dijagram koji prikazuje koji se mediji za kulturu rutinski koriste za različite izvore ili svrhe.
Mikrobne kulture mogu se uzgajati u Petrijevim zdjelicama različitih veličina koje imaju tanki sloj medija za rast na bazi agara. Nakon što se medij za rast u Petrijevoj zdjelici inokulira željenim bakterijama, ploče se inkubiraju na optimalnoj temperaturi za rast odabranih bakterija (na primjer, obično na 37 stepeni Celzijusa ili temperaturi ljudskog tijela, za kulture od ljudi ili životinja, ili nižoj za kulture iz okoliša). Nakon što se postigne željeni nivo rasta, agarne ploče se mogu čuvati naopako u frižideru duži vremenski period kako bi se bakterije sačuvale za buduće eksperimente.
Postoji niz aditiva koji se mogu dodati agaru prije nego što se izlije na ploču i ostavi da se stvrdne. Neke vrste bakterija mogu rasti samo u prisustvu određenih aditiva. Ovo se također može koristiti pri stvaranju inženjerskih sojeva bakterija koji sadrže gen otpornosti na antibiotike. Kada se odabrani antibiotik doda u agar, moći će rasti samo bakterijske ćelije koje sadrže genski umetak koji daje otpornost. Ovo omogućava i da se odabere samo kolonije koje su uspješno transformirane.
Mjerači na bazi agara Minijaturizirana verzija agarnih ploča implementirana u formate mjernih štapića, npr. Dip Slide, Digitalni mjerni štapić pokazuju potencijal za upotrebu na mjestu pružanja njege za dijagnostičke svrhe. Imaju prednosti u odnosu na agar ploče jer su isplative i njihov rad ne zahtijeva stručnost ili laboratorijsko okruženje, što im omogućava upotrebu na mjestu pružanja njege.
Selektivni i diferencijalni mediji Selektivni i diferencijalni mediji otkrivaju karakteristike mikroorganizama koji se na njima uzgajaju. Ova vrsta medija može biti selektivna, diferencijalna ili i selektivna i diferencijalna. Uzgoj kulture na više vrsta selektivnih i diferencijalnih medija može pročistiti miješane kulture i otkriti karakteristike potrebne za identifikaciju nepoznatih kultura.
Selektivni mediji Selektivni mediji se koriste za razlikovanje organizama tako što omogućavaju određenoj vrsti organizma da raste na njoj, a istovremeno inhibiraju rast drugih. Na primjer, eozin metilen plavo (EMB) može se koristiti za selekciju protiv Gram-pozitivnih bakterija, od kojih većina ometa rast na EMB-u, i za selekciju Gram-negativnih bakterija, čiji rast nije inhibiran na EMB-u. Diferencijalni mediji Naučnici koriste diferencijalne medije prilikom kultivacije mikroorganizama kako bi otkrili određene biohemijske karakteristike. Ove otkrivene osobine se zatim mogu uporediti sa atributima poznatih mikroorganizama u nastojanju da se identifikuju nepoznate kulture. Primjer za to je MacConkeyev agar (MAC), koji otkriva bakterije koje fermentiraju laktozu pomoću pH indikatora koji mijenja boju kada se fermentacijom proizvode kiseline.
Višeciljni paneli Na višeciljnim panelima, bakterije izolovane iz prethodno uzgojene kolonije se distribuiraju u svaki bunarčić, od kojih svaki sadrži medij za rast kao i sastojke za biohemijski test, koji će mijenjati apsorbanciju bunarčića u zavisnosti od bakterijskog svojstva testiranog cilja. Panel će biti inkubiran u mašini, koja potom analizira svaki bunarčić metodom zasnovanim na svjetlosti kao što je kolorimetrija, turbidimetrija ili fluorometrija. Kombinovani rezultati će se automatski uporediti sa bazom podataka poznatih rezultata za različite bakterijske vrste, kako bi se generirala dijagnoza o tome koje su bakterijske vrste prisutne u pdređenom panelu. Istovremeno, vrši se testiranje osjetljivosti na antibiotike.
Ubodne kulture thumb| Pokretne i nepokretne bakterije mogu se razlikovati duž linija uboda. Pokretne bakterije (lijevo) će rasti iz linije uboda, dok su nepokretne (desno) prisutne samo duž linije uboda. Kulture uboda su slične agarnim pločama, ali se formiraju čvrstim agarom u epruveti. Bakterije se uvode putem igle za inokulaciju ili vrha pipete koji se ubada u središte agara. Bakterije rastu u probušenom području. Ubodne kulture se najčešće koriste za kratkotrajno skladištenje ili transport kultura. Osim toga, ubodne kulture mogu otkriti karakteristike kultiviranih mikroorganizama kao što su pokretljivost ili potrebe za kisikom.
Kultura termofilnih mikroorganizama na čvrstoj ploči Za kulture termofilnih mikroorganizama na čvrstoj ploči kao što su Bacillus acidocaldarius, Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus i Thermus thermophilus'' itd., koji rastu na temperaturama od 50 do 70 stepeni Celzijusa, dokazano je da je niskoacilno pročišćena gelan guma preferirano sredstvo za želiranje u poređenju sa agarom za brojenje ili izolaciju ili oboje od gore navedenih termofilnih bakterija.Lin, Chi Chung and Casida, L. E. (1984) GELRITE as a Gelling Agent in Media for the Growth of Thermophilic Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology 47, 427–429.
Kolekcije ćelijskih kultura Kolekcije mikrobnih kultura fokusiraju se na akviziciju, autentifikaciju, proizvodnju, očuvanje, katalogizaciju i distribuciju održivih kultura standardnih referentnih mikroorganizama, ćelijskih linija i drugih materijala za istraživanje u mikrobna sistematika. Kolekcija kultura je također repozitorijum tip sojeva.