Metatranskriptomika je skup tehnika koje se koriste za proučavanje mikrobnih ekspresija gena unutar prirodnih okruženja, tj. metatranskriptoma.
Dok se metagenomika fokusira na proučavanje genomskog sadržaja i identifikaciju mikroba prisutnih unutar zajednice, metatranskriptomika se može koristiti za proučavanje raznolikosti aktivnih gena unutar takve zajednice, za kvantificiranje njihovih nivoa ekspresije i za praćenje kako se ovi nivoi mijenjaju u različitim uslovima (npr. fiziološka naspram patoloških stanja u organizmu). Prednost metatranskriptomike je u tome što može pružiti informacije o razlikama u aktivnim funkcijama mikrobnih zajednica koje bi inače izgledale slično. Uvod Mikrobiom je definiran kao mikrobna zajednica koja zauzima dobro definirano stanište. Ove zajednice su sveprisutne i mogu imati ključnu ulogu u održavanju karakteristika svog okruženja, a neravnoteža u ovim zajednicama može negativno uticati na aktivnosti okruženja u kojem borave. Za proučavanje ovih zajednica, a zatim i za utvrđivanje njihovog uticaja i korelacije s njihovom nišom korišteni su različiti omika pristupi. Dok metagenomika može pomoći istraživačima da generiraju „taksonomski“ profil uzorka, metatranskriptomika pruža „funkcionalni“ profil analizirajući koje gene zajednica eksprimira. Moguće je zaključiti koji se geni eksprimiraju pod određenim uvjetima, a to se može učiniti korištenjem funkcionalnih anotacija eksprimiranih gena.
Funkcija Budući da se metatranskriptomika fokusira na to koji se geni eksprimiraju, ona omogućava karakterizaciju aktivnog funkcionalnog profila cijele mikrobne zajednice. Pregled ekspresije gena u datom uzorku dobija se hvatanjem ukupne mRNA mikrobioma i izvođenjem metatranskriptomike cijelog mikrobioma sekvenciranje sačmaricom.
Alati i tehnike Iako se mikročipovi mogu iskoristiti za određivanje profila ekspresije gena nekih modelnih organizama, sekvenciranje sljedeće generacije i sekvenciranje treće generacije su preferirane tehnike u metatranskriptomici. Protokol koji se koristi za izvođenje analize metatranskriptoma može varirati ovisno o vrsti uzorka koji treba analizirati. Zaista, razvijeni su mnogi različiti protokoli za proučavanje metatranskriptoma mikrobnih uzoraka. Općenito, koraci uključuju sakupljanje uzoraka, ekstrakciju RNK (različite metode ekstrakcije za različite vrste uzoraka su opisane u literaturi), obogaćivanje iRNK, sintezu cDNK i pripremu metatranskriptomskih biblioteka, sekvenciranje te obradu i analizu podataka. Obogaćivanje iRNK je jedan od tehnički najzahtjevnijih koraka, za koji su predložene različite strategije: uklanjanje rRNK putem hvatanja ribosomske RNK korištenje 5-3 egzonukleaza za razgradnju obrađenih RNK (uglavnom rRNK i tRNK) dodavanje poli(A) iRNK, korištenjem poliA polimeraze (u ++E. coli’’) korištenje antitijela za hvatanje iRNK koje se vežu za specifične proteine Posljednje dvije strategije se ne preporučuju jer je prijavljeno da su vrlo pristrasne.
Računarska analiza Tipičan proces analize metatranskriptoma: mapira očitavanja na referentni genom, ili izvodi de novo sastavljanje očitavanja u transkriptne kontige i superkontige Prva strategija mapira očitavanja na referentne genome u bazama podataka, kako bi se prikupile informacije koje su korisne za određivanje relativne ekspresije pojedinačnih gena. Metatranskriptomska očitavanja se mapiraju u odnosu na baze podataka, pomoću alata za poravnanje, kao što su Bowtie2, BWA i BLAST. Zatim se rezultati označavaju korištenjem resursa, kao što su GO, KEGG, COG i Swiss-Prot. Konačna analiza rezultata se provodi ovisno o cilju studije. Jedna od najnovijih tehnika metatranskriptomike je sondiranje stabilnih izotopa (SIP), koja se koristi za pronalaženje specifičnih ciljanih transkriptoma aerobni mikrobi u jezerskom sedimentu. Ograničenje ove strategije je njeno oslanjanje na informacije referentnih genoma u bazama podataka.
Druga strategija pronalazi obilje u ekspresiji različitih gena sastavljanjem metatranskriptomskih očitavanja u duže fragmente nazvane contig koristeći različit softver. Trinity softver za RNK-seq, u poređenju s drugim de novo sastavljačima transkriptoma, navodno je otkrio više transkripata pune dužine u širokom rasponu nivoa ekspresije, sa osjetljivošću sličnom metodoma koji se oslanjaju na poravnanja genoma. Ovo je posebno važno u odsustvu referentnog genoma.
Kvantitativni proces za transkriptomsku analizu razvili su Li i Dewey. i naziva se RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization - RNA-Seq pomoću maksimizacije očekivanja). Može raditi kao samostalni softver ili kao dodatak (plug-in) za Trinity. RSEM počinje s referentnim transkriptomom ili sklopom zajedno s RNK-Seq očitavanjima generiranim iz uzorka i izračunava normaliziranu količinu transkripta (što znači da broj RNK-Seq očitavanja odgovara svakom referentnom transkriptomu ili sklopu).
Iako su i Trinity i RSEM dizajnirani za transkriptomske skupove podataka (tj. dobijene od jednog organizma), moguće ih je primijeniti na metatranskriptomske podatke (tj. dobijene od cijele mikrobne zajednice)..
Bioinformatika Upotreba alata za računarsku analizu postala je važnija kako su se mogućnosti sekvenciranja DNK povećale, posebno u metagenomskoj i metatranskriptomskoj analizi, koja može generirati ogromnu količinu podataka. U ove svrhe razvijeno je mnogo različitih bioinformatičkih cjevovoda, često kao platforme otvorenog koda poput HUMANN-a i novijih HUMANN2, MetaTrans, SAMSA, Leimena-2013 i mOTUs2.
HUMAnN2 HUMANN2 je bioinformatički cjevovod dizajniran iz prethodnog HUMANN softvera, koji je razvijen tokom Projekta ljudskog mikrobioma (HMP), implementirajući pristup "višeslojnog pretraživanja". U prvom sloju, HUMANN2 pregledava DNK ili RNK očitavanja pomoću MetaPhlAn2 kako bi identificirao već poznate mikrobe i konstruirao bazu podataka specifičnu za uzorak spajanjem pangenoma označenih vrsta; u drugom sloju, algoritam vrši mapiranje očitavanja u odnosu na sastavljenu bazu podataka pangenoma; u trećem sloju, neusklađena očitavanja se koriste za prevedenu pretragu u odnosu na proteinsku bazu podataka.
MetaTrans MetaTrans je cjevovod koji koristi multithreading za poboljšanje efikasnosti. Podaci se dobijaju iz RNK-Seq sparenih krajeva, uglavnom iz 16S RNK za taksonomiju i iRNK za nivoe ekspresije gena. Cjevovod je podijeljen u četiri glavna koraka. Prvo, očitavanja sparenih krajeva se filtriraju radi kontrole kvaliteta, zatim se sortiraju i filtriraju za taksonomsku analizu (uklanjanjem sekvenci tRNK) ili funkcionalnu analizu (uklanjanjem i tRNK i rRNK očitavanja). Za taksonomsku analizu, sekvence se mapiraju u odnosu na 16S rRNK Greengenes v13.5 bazu podataka koristeći SOAP2, dok se za funkcionalnu analizu sekvence mapiraju u odnosu na funkcionalnu bazu podataka kao što je MetaHIT-2014 uvijek korištenjem SOAP2 alata. Ovaj cjevovod je vrlo fleksibilan, jer nudi mogućnost korištenja alata trećih strana i poboljšanja pojedinačnih modula sve dok se očuva opća struktura..
SAMSA Ovaj cjevovod je posebno dizajniran za analizu metatranskriptomskih podataka, radeći u kombinaciji sa MG-RAST serverom za metagenomiku. Ovaj cjevovod je jednostavan za korištenje, zahtijeva nisku tehničku pripremu i računarsku snagu te se može primijeniti na širok spektar mikroba. Prvo, sekvence iz sirovih podataka sekvenciranja se filtriraju radi kvalitete, a zatim se šalju MG-RAST-u (koji provodi daljnje korake kao što su kontrola kvaliteta, pozivanje gena, grupiranje sekvenci aminokiselina i korištenje sBLAT-a na svakom klasteru za detekciju najboljih podudaranja). Podudaranja se zatim agregiraju u svrhu taksonomske i funkcionalne analize.
Leimena-2013 Ovaj cjevovod nema službeni naziv i obično se na njega referira koristeći prvog autora članka u kojem je opisan. Ovaj algoritam predviđa implementaciju alata za poravnanje kao što su BLAST i MegaBLAST. Očitavanja se grupišu u grupe identičnih sekvenci, a zatim obrađuju za in-silico uklanjanje sekvenci tRNK i rRNK. Preostala očitavanja se zatim mapiraju u NCBI baze podataka pomoću BLAST-a i MegaBLAST-a, a zatim klasificiraju prema njihovom bitskoru. Sekvence s višim bitskorovima koriste se za predviđanje filogenetskog porijekla i funkcije, a očitavanja s nižim bitscore-ovima se poravnavaju s osjetljivijim BLASTX-om i na kraju se mogu poravnati u bazama podataka proteina tako da se njihova funkcija može okarakterizirati.
mOTUs2 Profiler mOTUs2, ...koji se zasniva na esencijalnim genima domaćinstva, pokazao se kao vrlo pogodan za kvantifikaciju bazalne transkripcijske aktivnosti članova mikrobne zajednice. U zavisnosti od uslova okoline, broj transkripata po ćeliji varira za većinu gena. Izuzetak od ovoga su geni domaćinstva koji se konstitutivno eksprimiraju i sa niskom varijabilnosti pod različitim uslovima. Dakle, brojnost transkripata iz takvih gena snažno korelira s brojnošću aktivnih ćelija u zajednici.
Mikročipovi Drugi metod koji se može iskoristiti u metatranskriptomske svrhe su mikročipovi za popločavanje. Konkretno, mikročipovi su korišteni za mjerenje nivoa mikrobne transkripcije, za detekciju novih transkripata i za dobijanje informacija o strukturi iRNK (naprimjer, UTR granice). Nedavno se koristi i za pronalaženje novih regulatornih ncRNK. Međutim, mikročipovi imaju neke nedostatke: zahtjev za dizajn sonde niska osjetljivost prethodno poznavanje ciljnih gena.
RNK-Seq može prevladati ova ograničenja: ne zahtijeva nikakvo prethodno znanje o genomima koji se moraju analizirati i pruža visoku propusnost validacije predviđanja, strukture i ekspresije gena. Dakle, kombiniranjem dva pristupa moguće je imati potpuniji prikaz bakterijskog transkriptoma.
Ograničenja Sa svojom dominantnom količinom, ribosomska RNK snažno smanjuje pokrivenost iRNK (obično glavni fokus transkriptomskih studija) u ukupnoj prikupljenoj RNK. Ekstrakcija visokokvalitetne RNK iz nekih bioloških ili okolišnih uzoraka (kao što je izmet) može biti teška. Nestabilnost iRNK koja ugrožava integritet uzorka čak i prije sekvenciranja. Eksperimentalni problemi mogu utjecati na kvantifikaciju razlika u ekspresiji među više uzoraka: Mogu utjecati na integritet i ulaznu RNK, kao i na količinu rRNK koja ostaje u uzorcima, presjeku veličine i genskim modelima. Štaviše, tehnike molekularnih baza su vrlo sklone artefaktima. Teškoće u razlikovanju domaćina i mikrobne RNK, iako su dostupni komercijalni kitovi za mikrobno obogaćivanje. Ovo se također može uraditi in silico ako je dostupan referentni genom za domaćina. Referentne baze podataka transkriptoma su ograničene u svom obuhvatu. Općenito, velike populacije ćelija se koriste u metatranskriptomskoj analizi, tako da je teško razriješiti važne varijacije koje mogu postojati između subpopulacija. Pokazano je da visoka varijabilnost u populacijama patogena utiče na napredovanje bolesti i virulenciju. I za mikročipove i za RNK-Seq, teško je postaviti pravi prag za klasifikaciju gena kao "eksprimiranih", zbog visokog dinamičkog raspona u ekspresiji gena. Prisustvo iRNK nije uvijek povezano sa stvarnim prisustvom odgovarajućeg proteina.
Aplikacije
Ljudski crijevni mikrobiom
Crijevni mikrobiom se posljednjih godina pojavio kao važan saktor u ljudskom zdravlju. Njegove prevladavajuće funkcije povezane su s fermentacijom neprobavljivih komponenti hrane, konkurencijom s patogenima, jačanjem crijevne barijere, stimulacijom i regulacijom imunskog Sistema.
Iako se mnogo toga naučilo o mikrobiomu u posljednjih nekoliko godina, široka raznolikost mikroorganizama i molekula u crijevima zahtijeva nove alate koji omogućavaju nova otkrića. Fokusirajući se na promjene u ekspresiji gena, metatraskriptomika može generirati dinamičniju sliku stanja i aktivnosti mikrobioma nego metagenomika. Uočeno je da su metatraskriptomski funkcionalni profili varijabilniji nego što bi se moglo pretpostaviti samo na osnovu metagenomskih informacija. To ukazuje na to da geni koji nisu zaduženi za održavanje mikrobioma nisu stabilno eksprimirani in situ.