miniatura|Proteïna TH (en verd) als axons de neurones en un gangli mientèric. miniatura|Immunoreactivitat a la proteïna C9 del sistema del complement, en un miocardi amb un infart de menys de 6 h d'evolució. Tenyides de color marró (positivitat a la reacció) les zones de necrosi dels miocardiòcits. Microscopi òptic. 400X. La immunohistoquímica (IHQ) és un conjunt de tècniques d'histoquímica que permet reconèixer i/o diferènciar diferents trets o signes cel·lulars, mitjançant la unió antigen-anticòs. La part d'un antigen que interacciona amb un anticòs rep el nom d'epítop. Un antigen pot tenir diversos epítops, cadascun dels quals és identificat per un anticòs específic. La tinció immunohistoquímica es fa servir en el diagnòstic de cèl·lules anormals com les que es troben en els tumors cancerosos, entre altres afeccions. Determinats marcadors moleculars són característics de neoproliferacions i/o mort cel·lular (apoptosi) i d'altres es fan servir per localitzar i estudiar els diferents patrons d'expressió proteínica als teixits normals.
Etimologia La immunohistoquímica pren el seu nom de la construcció llatina in (a l'interior) + el verb munire (reforçar, fortificar), la qual fa referència als anticossos usats en el procediment, de la paraula grega ἱιστός/histós que significa teixit i de la paraula del mateix origen χημεία/khemeia (mescla de líquids).
Història Pocs anys després del descobriment dels anticossos neutralitzants sèrics per Von Behring (1890), l'austríac Rudolf Kraus (1868-1932) desenvolupà el test de la precipitina, demostrant així l'existència d'una reacció entre els anticossos i els antígens. L'any 1923, l'immunòleg estatunidenc Michael Heidelberger aconseguí quantificar aquesta reacció afegint tints als antígens i l'anglès John Marrack va fer possible visualitzar-la afegint tints als anticossos. Albert H. Coons fou el primer en aplicar la fluorescència en procediments immunohistoquímics. La immunohistoquímica fou emprada primordialment des de la dècada de 1940 per caracteritzar neoplàsies o tipificar agents infecciosos. A finals de la dècada de 1970 s'introduí el doble marcatge immunoenzimàtic peroxidasa/fosfatasa alcalina. Durant mig segle, els principals avenços se centraren en millorar la sensibilitat i l'especificitat de les tècniques i en augmentar el nombre de biomarcadors per teixits fixats amb formol i inclosos en blocs de parafina. La tendència actual, però, és aplicar la immunohistoquímica per detectar anomalies genètiques tumorals, trobar identificadors tissulars d'importància pronòstica i ajudar en la selecció eficaç de substàncies anticanceroses.
A la I Conferència i Taller Internacional sobre diferenciació dels antígens leucocitaris humans, celebrada a París el 1982, fou aprovada la terminologia CD (cúmul o grup de diferenciació o cluster of differentiation en anglès). Aquest mètode va ser adoptat per tal de classificar d'una manera uniforme els molts anticossos monoclonals generats per diversos laboratoris d'arreu del món contra epítops presents a les molècules de superfície dels leucòcits. En poc temps, l'abreviatura CD formà part de la nomenclatura habitual de la immunohistoquímica i el seu ús s'ha ampliat a una nombrosa quantitat d'altres tipus cel·lulars. Generalment, les cèl·lules es tipifiquen com CD+ o CD–, per indicar si algunes de les seves fraccions expressen un determinat cúmul de diferenciació o no. Per exemple, si una cèl·lula és CD34+ i CD31− significa que expressa el CD34 i no el CD31. Una lletra "w" abans del número significa que l'anticòs està pendent de ser classificat definitivament. Una lletra minúscula després del número vol dir que el cúmul en qüestió té diverses molècules que comparteixen una cadena de polipèptids comuna (una mostra de això són els CD1a, CD1b, CD1c, CD1d o CD1e). Fins al juny de 2020 s'havien identificat més de 370 cúmuls o subcúmuls de diferenciació.
A mitjans de la dècada de 1980 es crearen els primers sistemes parcialment automatitzats d'ús específic en immunohistoquímica i el 1990 fou dissenyat un aparell automàtic amb capacitat d'efectuar alhora immunohistoquímica i hibridació in situ per fluorescència (FISH, de l'anglès fluorescence in situ hybridization). Uns anys més tard, Photoshop i MATLAB van ser els primers programaris comercials emprats en immunohistoquímica per millorar la quantificació cromogènica. A molts centres hospitalaris i de recerca l'ús d'escàners d'alt rendiment ja forma part de la metodologia immunohistoquímica habitual.
Els nous usos de la immunohistoquímica permeten la progressiva integració d'aquest conjunt de tècniques de laboratori dins dels procediments de la medicina personalitzada.
Aspectes metodològics La interacció anticòs–antigen es pot visualitzar de diverses maneres. En la més comuna (la immunohistoquímica directa) un anticòs es conjuga a un enzim com la peroxidasa, que pot catalitzar una reacció que produeix color. Alternativament l'anticòs pot ser unit a un fluoròfor com la fluoresceïna o la rodamina (una substància orgànica heterocíclica derivada del xantè). En la immunohistoquímica indirecta el senyal de l'anticòs s'amplia mitjançant l'ús de capes successives de marcadors (polímers conjugats amb diferents anticossos primaris i agents reveladors), que proporcionen una major sensibilitat que la immunohistoquímica directa.
Els fluoròfors de nova generació (Alexa Fluor™, DyLight™) són, per regla general, més fotoestables i brillants i menys sensibles al pH que d'altres més antics amb característiques d'excitació i emissió similars. Aquestes substàncies poden unir-se de forma covalent als anticossos sense alterar la unió d'aquests amb els seus corresponents antígens, sent dita propietat molt útil per visualitzar de forma òptima els llocs on es produeix la reacció antigen-anticòs.
La fixació és un pas molt important per aconseguir tincions immunohistoquímiques de bona qualitat. És aconsellable fixar les mostres de teixit a tenyir amb formaldehid al 4 per cent tamponat a pH 7,4. El temps de fixació no pot ser de menys de 24 h ni superior a 48. Atès que certs antígens de superfície i receptors nuclears no toleren bé la fixació en formol; en aquests casos és necessari recórrer a la congelació o la fixació breu amb acetona, cloroform o amb una mescla de les dues substàncies. Si la mostra necessita ser descalcificada és convenient utilitzar el mètode més suau, preferiblement EDTA. En cas de descalcificació prèvia amb àcids forts, és imprescindible efectuar un rentat curós de la mostra amb aigua. Si el material és sotmès a inclusió en parafina, aquesta ha de tenir un punt de fusió baix, ja que a temperatures elevades es perd immunoreactivitat.
Cal considerar també el gruix del tall micròtomic a observar, sobretot quan el grau de marcatge és un paràmetre important per avaluar la gravetat o la fase evolutiva d'una malaltia. Un tall massa prim pot impedir una bona tinció de zones tissulars o cel·lulars formades per diferents proteïnes. Per altra banda, si el tall és excessivament gruixut, el pes molecular de l'anticòs pot tenir una influència no desitjada en la distribució espacial de les seves molècules dins de la mostra.
La immunoreactivitat de diversos tipus cel·lulars presents en els talls histològics fixats amb formol i inclosos en parafina, com els macròfags en especial, disminueix amb el pas del temps; per això, i a la fi de possibilitar una correcta tinció immunohistoquímica diferida, és convenient conservar congelades les mostres a –80 °C.
L'augment de la importància diagnòstica dels marcadors immunohistoquímics proteòmics i intracel·lulars fa imprescindible l'ús de tècniques dirigides a bloquejar l'activitat de les peroxidases endògenes del teixit, per tal d'evitar falsos positius i errors derivats d'alteracions artefactuals en aquesta classe de tincions.
Els falsos negatius (manca de reactivitat d'un anticòs davant l'antigen pel qual ha estat dissenyat) són força difícils de detectar. Poden ser causats per factors preanalítics (retard entre l'extracció de la mostra i la fixació, sobrefixació, desparafinat incomplet), analítics (dilució excessiva de l'anticòs primari o de qualsevol dels reactius emprats, temps d'incubació insuficient, omissió d'alguna etapa del protocol) o postanalítics (contratinció massa forta, interpretació errònia).
L'estudi dels resultats ha de seguir uns criteris objectius de quantificació. Per entendre i avaluar correctament aquest tipus de tincions, cal tenir presents alguns punts bàsics: No hi ha un marcador perfecte per a cap mena de tumor; no hi ha un mètode de fixació perfecte per a tots els anticossos; si totes les estructures d'una secció de teixit semblen positives, el procediment immunohistoquímic està mal fet; si el procediment està mal fet, qualsevol anticòs pot semblar positiu en qualsevol teixit, i si tot tall histològic es tenyeix de marró (o de negre, o de vermell, etc.), la tinció no és vàlida.
La positivitat davant determinats marcadors immunohistoquímics es pot produir a diferents estructures cel·lulars i tissulars. Per exemple: el nucli per als marcadors Ki-67, p63, WT-1, PR, ER, CDX-2 i TTF-1; el nucli el citoplasma per a S-100, calretinina i p16; el citoplasma per a PSA, citoqueratines i tiroglobulina; la CD15 i CD30, i la matriu extracel·lular per a per a CD45, CD3, CD20, HER2/neu i vil·lina; la membrana i l'aparell de Golgi per al col·lagen tipus IV.
Es poden efectuar dobles tincions (o triples, fins i tot) immunohistoquímiques en una mateixa preparació tissular, sempre que els antígens a marcar no es trobin a la mateixa estructura (nucli, membrana, citoplasma), i hi ha un considerable nombre de combinacions possibles.
S'ha desenvolupat un sistema d'immunohistoquímica automàtic, basat en la detecció del cicle cel·lular, que permet l'anàlisi del comportament cinètic de les cèl·lules neoplàsiques en determinats tumors, com ara els colorectals, una característica important per a l'avaluació dels efectes adjuvants de la teràpia preoperatòria.
La immunohistoquímica és un complement molt important, però no un substitut, de la histologia. Moltes malalties no tenen un anticòs diagnòstic únic i/o específic; per aquest motiu s'han dissenyat panells immunohistoquímics (agrupacions de diversos anticossos que han d'incloure almenys un anticòs negatiu) ajustats al diagnòstic histològic presumptiu d'un determinat procés, sigui tumoral o no, i que s'actualitzen segons l'evolució dels coneixements científics. Per exemple, existeixen panells dirigits a la filiació de carcinomes d'origen desconegut o específicament orientats envers la diagnosi dels tumors de parts toves.
Avui dia, una de les principals limitacions de la immunohistoquímica convencional és el fet que els resultats s'obtenen habitualment per mitjà d'una avaluació visual qualitativa o semiquantitativa. Si bé això és suficient per efectuar diagnòstics, l'anàlisi amb finalitats predictives d'una considerable quantitat de biomarcadors combinats/integrats que tenen expressions diferents fa necessària l'adopció de procediments no subjectius més precisos i reproduïbles. Per una altra banda, els nous avenços en proteòmica tissular requereixen dades espacials bidimensionals que impliquen aconseguir un ampli i dinàmic ventall de resultats sobre l'expressió de proteïnes en el material a estudiar mitjançant la immunohistoquímica. Davant d'aquests problemes, l'actual generació de mètodes immunohistoquímics incorpora de forma creixent l'ús de tecnologies digitals d'eficiència provada adaptades al flux de treball anatomopatològic i als sistemes d'informàtica biomèdica.
Marcadors immunohistoquímics