miniatura|458x458px|Primeres 90 posicions d'un alineament de múltiples seqüències de la proteïna acídica ribosomal P0 (L10E) de diversos organismes. Generat amb ClustalX. Lalineament múltiple de seqüències (MSA, per les sigles en anglès) es refereix al procés o resultat d'un alineament de seqüències de tres o més seqüències biològiques, generalment proteïnes, ADN o ARN. En alguns casos, es poden trobar relacions evolutives i inclús l'avantpassat comú. En cas que es vulgui inferir homologia s'ha de recórrer a l'anàlisi filogenètic.
Podríem considerar que un MSA és una organització matricial d'un grup de seqüències, en la qual cada fila correspon a una seqüència diferent (per exemple, d'espècies diferents) i cada columna correspon a una posició equivalent en les seqüències. Les representacions visuals de l'alineament mostren les mutacions puntuals (un únic canvi d'aminoàcid o de nucleòtid) que apareixen com diferents caràcters en una mateixa columna, així com les insercions o delecions de fragments, conegudes com a indels, que apareixen com buits a les seqüències.
Per dur a terme aquest procés s'usen algorismes computacionals per produir i analitzar els alineaments. La major part dels programes utilitzen mètodes heurístics en canvi d'optimitzacions globals, ja que trobar un alineament global per moltes seqüències és costós a nivell computacional. Per altra banda, les solucions heurístiques no et donen garanties sobre la qualitat de les mateixes i solen estar per sota de la solució òptima.
Mètodes d'alineament Hi ha diversos mètodes d'alineament que s'utilitzen dintre dels alineaments de seqüències múltiples per maximitzar les puntuacions i la correcció dels alineaments.
Programació dinàmica miniatura|Exemple de matriu de substitució per a mètodes de programació dinàmica. |246x246px Un mètode directe per produir MSA és l'ús de tècniques de programació dinàmica amb l'objectiu d'identificar la solució d'alineament òptim. Per proteïnes aquest mètode implica dos paràmetres: una penalització per gap (indel) i una matriu de substitució, que consistiria a alinear cada parell d'aminoàcids basant-se en les propietats químiques i la probabilitat evolutiva que ocorri la mutació. Per les seqüències nucleotídiques s'utilitza una penalització semblant, però les matrius de substitució són més simples, ja que només hi ha quatre caràcters possibles, només es consideren puntuacions positives en casos de coincidencia (match) i puntuació negativa en els casos de desigualtat (mismatches). Les puntuacions de les matrius de substitució poden ser positives o una combinació de positives i negatives en el cas dels alineaments globals, però en el cas d'un alineament local s'han de tenir en compte les positives i les negatives.
Per n seqüències individuals, el mètode requereix reconstruir l'equivalent n-dimensional de la matriu formada a l'alineament estàndard dels parells de seqüències. D'aquesta forma hi ha un increment exponencial de l'espai de cerca a mesura que va augmentant n, fet que també dependrà de la longitud de la seqüència. La troballa de l'óptim global per n seqüències mitjançant aquest mètode es considera com un problema NP-complet. El 1989, basat en lalgorisme Carrillo-Lipman, Altschul va introduir un mètode pràctic que utilitzava els alineaments parells per restringir l'espai de cerca n-dimensional. En aquest enfocament els alineaments de programació dinàmica per parells es realitzen a cada parell de seqüències del conjunt de consultes, i només es busca l'alineament a l'espai n-dimensional (es troba de forma efectiva la intersecció entre les trajectòries locals dels voltants immediats de cada solució òptima de l'alineament per parells). Actualment els mètodes de programació dinàmica només s'utilitzen quan es necessita un alineament d'alta qualitat entre un petit nombre de seqüències, així com benchmark estàndard en l'avaluació de tècniques heurístiques noves o millorades.
Construcció progressiva de l'alineament És el mètode més utilitzat per dur a terme l'alineament múltiple de seqüències. Utilitza una recerca heurística coneguda com a tècnica progressiva (també conegut com a mètode jeràrquic o arbre) desenvolupat per Da-Fei Feng i Doolittle el 1987. L'alineament progressiu crea un MSA combinant alineaments de parelles començant per les parelles més similars i progressant cap a les més llunyanes. Tots els alineaments progressius requereixen dues passes: el primer pas on les relacions entre seqüències són representades com un arbre filogenètic, anomenat arbre guia, i un segon pas on es construeix el MSA afegint progressivament les seqüències per construir l'alineament d'acord amb l'arbre guia. L'arbre guia inicial està determinat per un algorisme d'agrupament (clustering en anglès), com podrien ser els mètodes de neighbor-joining (o "unió de veïns") o UPGMA (de l'anglès Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). A més, utilitza distàncies basades en el nombre de subseqüències idèntiques de dues lletres (ús de FASTA en lloc d'una alineació de programació dinàmica). miniatura|349x349px|Esquema representant el procediment per a l'obtenció d'un alineament de seqüències múltiples mitjançant mètodes de construcció progressiva. El principal problema dels alineaments progressius és que si es produeix en qualsevol etapa del creixement del MSA, s'afectarà el resultat final, per tant és important una bona assignació inicial del parentesc entre les seqüències. El rendiment és baix quan totes les seqüències del conjunt estan relacionades de manera llunyana. Alguns mètodes progressius més moderns modifiquen la seva funció de puntuació amb una funció de ponderació secundària, que assigna factors d'escala als membres individuals de la consulta establerts de manera no lineal, en funció de la seva distància filogenètica, respecte als seus veïns més propers. Això corregeix la selecció no aleatòria de les seqüències donades al programa.
Aquests mètodes són suficientment eficients per a poder ser implementats a gran escala per a moltes seqüències, i s'executen sovint a servidors web d'accés públic, de manera que els usuaris no necessiten instal·lar localment les aplicacions. El mètode d'alineament progressiu més conegut és la família Clustal,Higgins DG, Sharp PM. (1988). CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73(1):237-44. especialment la seva variant ponderada ClustalW,Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22:4673-4680. al qual es pot accedir a través d'un gran nombre de portals web, com ara GenomeNet, EBI i EMBNet . Clustal s'utilitza principalment en la creació d'arbres filogenètics i com a base per a la predicció d'estructura de proteïnes mitjançant models d'homologia. La darrera versió de la família Clustal i recomanada per l'EMBL-EBI és Clustal Omega, el qual es basa en arbres guia arrelats i tècniques de models de Màrkov ocults per fer alineament de proteïnes. Un altre programa habitual és T-Coffee que no ofereix la rapidesa de Clustal, però produeix alineaments més precisos per a conjunts de seqüències emparentades de forma llunyana.
Al basar-se en l'heurística pot ser difícil avaluar la qualitat de l'alineament i la seva significació biològica. El programa PSAlign és un mètode semiprogressiu que té com a objectiu la millora de la qualitat de l'alineament, ja que no utilitza una heurística “amb pèrdues” i s'executa en temps polinòmic.
Mètodes iteratius Es tracta d'uns mètodes per produir MSA que redueixen els errors inherents en els mètodes progressius. S'anomenen “iteratius” perquè treballen d'una manera semblant als mètodes progressius, però realineen de manera repetida les seqüències inicials i afegeixen de noves al MSA en construcció. Un dels motius pels quals els mètodes progressius depenen en gran manera d'una alta qualitat de l'alineament inicial és perquè aquests alineaments sempre s'inclouran al resultat final, ja que un cop la seqüència s'introdueix al MSA no es tornarà a fer l'alineament. Aquesta aproximació millora l'eficiència a costa de la precisió. En canvi, com ja hem vist, els mètodes iteratius poden tornar als alineaments parells calculats prèviament (o sub-MSAs) incorporant subconjunts de la seqüència problema com a mesura per optimitzar una funció objectiu general, així com buscar l'alineament amb la puntuació més alta.
S'han implementat diversos mètodes subtilment diferents i estan disponibles en paquets de programari; els articles de revisió i les comparacions són útils, però normalment s'abstenen d'escollir quina és la “millor” tècnica. El paquet de programari PRRN/PRRP utilitza un algorisme hill climbing (o "algorisme d'escalada") per optimitzar la puntuació del MSA. PRRP té un millor rendiment quan refina un alineament construït prèviament per un mètode més ràpid.
Un altre programa iteratiu, DIALIGN, adopta un enfocament inusual centrant-se en els alineaments locals entre subsegments o motius de seqüència sense introduir un penalització per gap. L'alineament de motius individuals s'aconsegueix amb una representació en forma de matriu semblant a les matrius de punts (dot-matrix en anglès) en els alineaments parells. Hi ha un mètode alternatiu que utilitza alineaments locals ràpids com a punts d'ancoratge per a un procediment d'alineament global més lent, el qual s'implementa a CHAOS/DIALIGN.
El tercer mètode iteratiu conegut es coneix com a MUSCLE (de les sigles en anglès, MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation) i millora els mètodes progressius. El que fa és mesurar una distància més acurada per avaluar la relació entre dues seqüències. La mesura de la distància s'actualitza entre les etapes d'iteració (tot i que originàriament, MUSCLE contenia només 2-3 iteracions depenent si el refinament estava habilitat o no).
Mètodes consens Els mètodes consens pretenen trobar el MSA òptim d'entre els diferents alineaments del mateix grup de seqüències. Hi ha dos mètodes comuns utilitzats: M-COFFEE i MergeAlign. M-COFFEE utilitza MSA generats de set formes diferents, ja que combina els outputs de diferents alineadors. MergeAlign és capaç de generar alineaments consens a partir de qualsevol nombre d'alineaments introduïts utilitzant models d'evolució de seqüències entre d'altres. L'opció per defecte de MergeAlign és inferir l'alineament consens utilitzant alineaments generats utilitzant 91 models diferents d'evolució de la seqüència proteica, això és possible per l'ús de diferents matrius de substitució d'aminoàcids, que és més acurat que no pas l'ús d'una única matriu.
Models de Màrkov ocults miniatura|408x408px|Esquema representant el funcionament i aplicació de HMM per a l'obtenció d'alineaments de múltiples seqüències. Els models ocults de Màrkov o HMM (per les seves sigles de l'anglès Hidden Màrkov Models) són models probabilístics que assignen probabilitats a totes les possibles combinacions de buits (gap), coincidències (match) i diferències (mismatch) per determinar alineament múltiple de seqüències o el conjunt d'aliments més probables. Els HMM poden produir un resultat únic amb la puntuació més alta, o també poden generar una família de possible alineacions que després es poden avaluar segons la seva significació biològica. Els HMM poden produir tant alineaments globals com locals. Tot i que els mètodes basats en HMM s'han desenvolupat recentment, ofereixen millores significatives pel que fa a velocitat computacional, especialment per a seqüències que contenen regions superposades.