A electroforese capilar (EC ou, en inglés, CE) é unha familia de métodos de separación electrocinéticos que se realizan en capilares submilimétricos e en canais micro e nanofluídicos. Moi a miúdo a electroforese capilar refírese á electroforese en zona capilar (EZC ou CZE), pero outras técnicas electroforéticas pertencen tamén a esta clase de métodos, como son a electroforese en xel capilar (EXC ou CGE), o isoelectroenfoque capilar (IEEC ou CIEF), a isotacoforese capilar e a cromatografía electrocinética micelar (CECM ou MEKC).Graham Kemp, Capillary electrophoresis: a versatile family of analytical techniques Biotechnology and Applied Biochemistry (1998) 27, (9–17) Nos diversos métodos de electroforese capilar, os analitos migran a través de solucións de electrólitos baixo a influencia dun campo eléctrico. Os analitos poden ser separados segundo a súa mobilidade iónica, e adicionalmente poden ser concentrados por medio de gradientes de condutividade e pH.
Instrumentación A instrumentación necesaria para levar a cabo unha electroforese capilar é relativamente simple. Un sistema básico esquemático de electroforese capilar é o que se mostra na figura 1. Os principais compoñentes do sistema son un vial de mostras, outros viais que funcionan como viais fonte e viais de destino, capilares, eléctrodos, unha fonte eléctrica de alta voltaxe, un detector, e un dispositivo para manexar os datos obtidos. O vial fonte, o de destino e o capilar énchense cun electrólito como é unha solución tampón acuosa. Para introducir a mostra, o extremo de entrada do capilar sitúase nun vial que contén a mostra. A mostra introdúcese no capilar por acción capilar, presión, extracción con sifón, ou electrocineticamente, e o capilar devóvlese despois ao vial fonte. A migración dos analitos iníciase ao aplicar un campo eléctrico entre os viais fonte e de destino que chega aos eléctrodos desde o cable de alta voltaxe. No modo máis común de electroforese capilar todos os ións, positivos ou negativos, son pulados a través do capilar na mesma dirección por fluxo electrosmótico, como se explicará máis adiante. Os analitos sepáranse a medida que migran debido á súa mobilidade electroforética e son detectados preto do extremo de saída do capilar. A saída de datos do detector envíase a un aparello que manexa os datos, como un integrador ou un computador. Os datos móstranse despois nun electroferograma, que informa da resposta do detector en función do tempo. Os compostos químicos que se separaron na electroforese aparecen no electroferograma como picos con diferentes tempos de retención nun electroferograma.Skoog, D.A.; Holler, F.J.; Crouch, S.R "Principles of Instrumental Analysis" 6th ed. Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007. Richard D. Smith e colaboradores foron os primeiros que combinaron a electroforese capilar coa espectrometría de masas, o que proporciona unha sensibilidade extremadamente grande para a análise de tamaños de mostra moi pequenas. Malia o pequeno tamaño das mostras (xeralmente só se introducen no capilar uns poucos nanolitros de líquido), conséguese unha alta sensibilidade e picos nítidos, en parte debido ás estratexias de inxección que dan lugar a unha concentración de analitos nunha zona estreita preto do extremo de entrada do capilar. Isto pode conseguirse nas inxeccións a presión ou nas electrocinéticas simplemente ao suspender a mostra nun tampón de condutividade menor (por exemplo, con concentracións salinas baixas) que a do tampón que se corre. Un proceso chamado empillamento de mostra amplificada de campo (field-amplified sample stacking, que é unha forma de isotacoforese) orixina unha concentración do analito nunha zona estreita na fronteira entre a mostra de baixa condutividade e o tampón que se corre de maior condutividade.
miniatura|300 px|Figura 1: Diagrama dun sistema de electroforese capilar.
Para conseguir un maior rendemento da mostra, úsanse instrumentos con matrices (arrays) de capilares cos que se analizan moitas mostras simultaneamente. Estes instrumentos de electroforese con matrices de capilares (CAE) con de 16 a 96 capilares utilízanse para a secuenciación de ADN capilar de alto ou medio rendemento, e os extremos de entrada dos capilartes dispóñense espacialmente para recibiren as mostras directamente desde unha placas de 96 pozos de dimensións SBS estándar96-Well Plate Footprint Dimensions – ANSI/SLAS 1-2004 (R2012) ver imaxe. Certos aspectos da instrumentación (como a detección) son necesariamente máis complexos que no sistema dun só capilar, mais os principios fundamentais do deseño e funcionamento son similares aos que se mostraron na figura 1.
Detección A separación por electroforese capilar pode detectarse por medio de diversos dispositivos. A maioría dos sistemas comerciais usan absorbancia UV ou UV-Vis como modo principal de detección. Nestes sistemas, utilízase unha sección do propio capilar como célula de detección. O uso dunha detección no propio tubo permite a detección de analitos separados sen perda de resolución. En xeral, os capilares usados na electroforese capilar están cubertos cun polímero (frecuentemente poliimida ou Teflon) para incrementar a flexibilidade. porén, a porción do capilar utilizado para a detección de luz UV debe ser opticamente transparente. Nos capilares cubertos de poliimida, un segmento do recubrimento é xeralmente quiemado ou retirado por raspado para proporcionar unha fiestra libre de cobertura de varios milímetros de longo. Esta sección espida do capilar pode romper facilmente, e existen capilares con recubrimentos transparentes que incrementan a estabilidade da fiestra da célula. A lonxitude do camiño percorrido (path length) da célula de detección na electroforese capilar (~ 50 micrómetros) é moito menor que na célula UV tradicional (~ 1 cm). Esta "lonxitude do camiño" (path enght) defínese como a distancia á que a luz (UV/VIS) viaxa ao atravesar unha mostra nunha célula analítica. Segundo a lei de Beer-Lambert, a sensibilidade do detector é proporcional á lonxitude do camiño óptico da célula. Para mellorar a sensibilidade, pode incrementarse esta lonxitude, aínda que isto ten como resultado unha perda de resolución. O propio tubo do capilar pode expandirse no punto de detección, creando unha "célula burbulla" cunha maior lonxitude do camiño ou poden engadirse tramos de tubo adicionais no punto de detección como se mostra na figura 2. Con todo, ambos os métodos fan decrecer a resolución da separación.Skoog, D.A.; Holler, F.J.; Crouch, S.R "Principles of Instrumental Analysis" 6th ed. Chapter 30 Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007. Tamén se describiu unha detección post-columna que utiliza unha configuración de fluxo laminar.
miniatura|300 px|Figura 2: Técnicas para incrementar a lonxitude do camiño óptico do capilar: a.) unha célula de burbulla e b.) unha célula z (tramos de tubo adicionais).
A detección por fluorescencia pode usarse tamén na electroforese capilar para mostras que fluorescen de forma natural ou son modificadas quimicamente para conter etiquetas fluorescentes. Este modo de detección ofrece unha alta sensibilidade e mellora a selectividade para estas mostras, pero non pode utilizarse para mostras que non presenten fluorescencia. Úsanse numerosas estratexias de etiquetado para crear derivados fluorescentes ou conxugados de moléculas non fluorescentes, incluíndo proteínas e ADN. A configuración para a detección por fluorescencia pode ser complicada nun sistema de electroforese capilar. O método require que o raio de luz estea enfocado no capilar, o cal pode ser difícil de facer con moitas fontes de luz. Utilizouse a fluorescencia inducida por láser en sistemas de electroforese capilar con límites de detección moi baixos de 10−18 a 10−21 mol. A sensibilidade da técnica atribúese á alta intensidade da luz incidente e á capacidade de enfocar axeitadamente a luz no capilar. A detección por fluorescencia multicolor pode conseguirse ao incluír espellos dicroicos múltiples e filtros de paso de banda para separar a emisión de fluorescencia entre múltiples detectores (por exemplo, tubos fotomultiplicadores), ou utilizando un prisma ou retícula para proxectar a emisión de fluorescencia resolta espectralmente sobre un detector sensible á posición, como unha matriz CCD. Os sistemas de electroforese capilar con sistemas de detección LIF de 4 ou 5 cores son os que se usan normalmente para a secuenciación do ADN capilar e as aplicacións de xenotipado ("perfil de ADN").
Para obter a identidade dos compoñentes dunha mostra, a electroforese capilar pode acoplarse directamente con espectrofotómetros de masas ou Espectroscopia Raman Amplificada na Superficie (SERS, Surface Enhanced Raman Spectroscopy). Na maioría dos sistemas, o extremo de saída do capilar introdúcese nunha fonte de ións que utiliza ionización de electrospray (ESI). Os ións resultantes son despois analizados polo espectrómetro de masas. Esta configuración require solucións tampón volátiles, que afectarán ao rango dos modos de separación que se poden empregar e ao grao de resolución que se pode conseguir. A medida e a análise fanse principalmente cun software de análise en xel especializado.
Para a electroforese capilar SERS, os eluentes poden depositarse nun substrato activo para SERS. Os tempos de retención do analito poden ser traducidos en distancias espaciais movendo o substrato activo para SERS a unha velocidade constante durante a electroforese capilar. Isto permite que a subseguinte técnica espectroscópica se aplique a eluentes específicos para a identificación con alta sensibilidade. Poden escollerse substratos activos para SERS que non interfiran co espectro dos analitos.Lin H.; Natan, M.; Keating, C. Anal. Chem. 2000, 72, 5348-5355.
Modos de separación A separación de compostos por electroforese capilar depende da migración diferencial dos analitos no campo eléctrico aplicado. A velocidade de migración electroforética () dun analito cara ao eléctrodo de carga oposta é:
A mobilidade electroforética pode determinarse experimentalmente a partir do tempo de migración e da forza do campo:
onde é a distancia desde o extremo de entrada do capilar ao punto de detección, é o tempo requirido polo analito para chegar ao punto de detección (tempo de migración), é a voltaxe aplicada (forza do campo), e é a lonxitude total do capilar. Como só as partículas cargadas (ións) son afectadas polo campo eléctrico, os analitos neutros sepáranse mal na electrrofrese capilar.
A velocidade de migración dun analito na electroforese capilar depende tamén da velocidade do fluxo electroosmótico (FEO ou EOF) da solución tampón. Nun sistema típico, o fluxo electroosmótico é dirixido cara ao cátodo (cargado negativamente), para que o tampón flúa a través do capilar desde o vial fonte ao vial de destino. Os analitos, ao írense separando polas súas diferentes mobilidades electroforéticas, migran cara ao eléctrodo de carga oposta. Como resultado, os analitos cargados negativamente son atraídos ao ánodo cargado positivamente, en contra do fluxo electroosmótico, mentres que os analitos cargados positivamente son atraídos ao cátodo, de acordo co fluxo electroosmótico que se mostra na figura 3.
miniatura|300px|Figura 3: Diagrama da separación de analitos cargados e neutros (A) segundo as súas respectivas mobilidades electrforéticas e de fluxo electroosmótico.
A velocidade do fluxo electroosmótico, pode expresarse como:
onde é a mobilidade electroosmótica, a cal se define como:
onde é o potencial zeta da parede capilar, e é a permitividade relativa da solución tampón. Experimentalmente, a mobilidade electrosmótica pde determinarse medindo o tempo de retención dun analito neutro. A velocidade () dun analito situado nun campo eléctrico pode ser definida así: