A N-etilmaleimida (NEM) é un composto orgánico que deriva do ácido maleico. Contén un grupo funcional imida, pero a súa característica máis importante é que é un alqueno que reacciona con grupos tiol e utilízase comunmente para modificar residuos de cisteína en proteínas e péptidos.Thiol reactive probes at Invitrogen
Química orgánica A NEM é un aceptor de Michael, o que significa que engade nucleófilos a grupos tiol. Os tioéteres resultantes presentan un forte enlace C-S e a reacción é virtualmente irreversible. A reacción con grupos tiol ocorre no intervalo de pH de 6,5 a 7,5. A NEM pode reaccionar con aminas ou sufrir hidrólise a pH máis alcalino. A NEM foi amplamente utilizada para probar o papel funcional de grupos tiol en encimoloxía. A NEM é un inhibidor irreversible de todas as cisteína peptidases, e a alquilación ten lugar no grupo tiol do sitio activo (ver esquema).Nelson, D. L.; Cox, M. M. "Lehninger, Principles of Biochemistry" 3rd Ed. Worth Publishing: New York, 2000. ISBN 1-57259-153-6.Gregory, J. D. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77, 3922-3923 miniatura|esquerda|500px|Mecanismo da inhibición irreversible dunha cisteína peptidase con NEM.
Experimentación En experimentos demostrouse que a NEM bloquea a fusión das membranas das vesículas sinápticas coa membrana plasmática da neurona presináptica durante a neurotransmisión ao inactivar un factor natural presente nas neuronas, que se denominou factor sensible á N-etilmaleimida ou NSF. Este factor foi descuberto por James Rothman e colegas en 1987, que o identificaron ao observar a súa inactivación polo tratamento con NEM. Este ensaio permitiulles purificar o NSF.
En tampóns de lise, utilízase NEM a 20 a 25 mM para inhibir a des-sumoilación de proteínas para análises de western blot. A NEM tamén se utilizou como inhibidor de des-ubiquitinases.
Arthur Kornberg e colegas utilizaron a NEM para inutilizar a ADN polimerase III para comparar a súa actividade coa da ADN polimerase I (pol III e I, respectivanmente). Kornberg fora galardoado co Premio Nobel polo seu descubrimento da pol I, que daquela se cría que era a utilizada para a replicación do ADN bacteriano, aínda que neste experimento demostrou que, realmente, a pol III era o encima utilizado pola maquinaria replicativa.
A NEM activa o fluxo de K dependente de Cl insensible á ouabaína en glóbulos vermellos de ovella e cabra.A chloride dependent K+ flux induced by N ethylmaleimide in genetically low K+ sheep and goat erythrocytes.P.K. Lauf and B.E. Theg. Biochem. Biophys. Res. Comm., 92:1422, 1980 Este descubrimento contribuíu á identificación molecular do cotransportador K-Cl (KCC) nas células embrionarias humanas transfectadas polo ADNc da isoforma KCC1, 16 anos despois.Gillen CM, Brill S, Payne JA, Forbush B 3rd: Molecular cloning and functional expression of the K-Cl cotransporter from rabbit, rat, and human. A new member of the cation-chloride cotransporter family.J Biol Chem. 1996 Jul 5;271(27):16237-44 Desde entón, a NEM foi amplamente utilizada como ferramenta de diagnóstico para descubrir ou manipular a presenza nas membranas de cotransportador K-Cl en células de moitas especies animais.Regulation of K-Cl cotransport: from function to genes. N. C. Adragna, M. Di Fulvio and P.K. Lauf, J. Membrane Biology, 200:1-29, 2004 Malia os repetidos intentos fracasados para identificar quimicamente o grupo tiol cargado,K+ Cl Cotransport: Sulfhydryl, divalent cations and the mechanism of volume activation in a red cell. P.K. Lauf. Topical Review, J. Memb. Biol. 88:1 13, 1985 a pH fisiolóxico, a NEM pode formar adutos con grupos tiol de proteína quinases que fosforilan o cotransportador de K-Cl (KCC) en residuos específicos de serina e treonina principalmente no dominio C-terminal do transportador. A subseguinte desfosforilación do KCC por proteína fosfatases causa a activación do KCC.Jennings, M. L. & Al-Rohil, N. S. J. gen. Physiol. 95, 1021−1040, 1990
Notas
Véxase tamén Ligazóns externas Base de datos MEROPS para peptidases e os seus inhibidores: NEM
Categoría:Compostos químicos Categoría:Bioquímica