A ERCC4 é unha proteína tamén chamada endonuclease de reparación do ADN XPF, que nos humanos está codificada no xene ERCC4 do cromosoma 16. Xunto coa proteína ERCC1, ERCC4 forma o complexo encimático ERCC1-XPF, que participa na reparación e recombinación do ADN.
O encima nuclease ERCC1-XPF corta estruturas específicas do ADN. Moitos aspectos destes dous produtos xénicos describiranse conxuntamente porque actúan xuntos durante a reparación do ADN. A actividade da nuclease ERCC1-XPF é esencial na vía de reparación por escisión de nucleótidos do ADN. A nuclease ERCC1-XPF tamén funciona en vías de reparación de roturas de dobre febra do ADN, e na reparación de danos por formación de "enlaces cruzados" que ligan anormalmente as dúas febras do ADN.
As células con lesións incapacitantes no xene ERCC4 son máis sensibles do normal a determinados axentes que danan o ADN, como a radiación ultravioleta e compostos químicos que causan a formación de enlaces cruzados entre as febras do ADN. Os ratos modificados por enxeñaría xenética con mutacións que inhabilitan o xene ERCC4 teñen tamén defectos na reparación do ADN, así como cambios fisiolóxicos inducidos polo estrés metabólico, que orixinan un envellecemento prematuro. A deleción completa de ERCC4 orixina ratos non viables, pero en humanos non se encontraron individuos cunha deleción completa (homocigota) de ERCC4. Hai casos raros na poboación humana de portadores de mutacións herdadas que impiden o funcionamento de ERCC4. Cando os xenes normais están ausentes, estas mutacións poden orixinar en humanos algunhas síndromes, como o xeroderma pigmentoso, a síndrome de Cockayne ou a anemia de Fanconi.
ERCC4 e ERCC1 son os nomes utilizados para os xenes humanos e Ercc1 e Ercc4 son os nomes dos xenes análogos noutros mamíferos. Xenes similares con funcións semellantes atópanse en todos os organismos eucariotas.
Xene
O xene ERCC4 humano pode corrixir os defectos na reparación do ADN en liñas de células mutantes específicas sensibles á luz ultravioleta derivadas de células de ovario de hámster chinés. Illáronse múltiples grupos de complementación independentes de células de ovario do hámster chinés, e este xene restauraba a resistencia á radiación ultravioleta en células do grupo de complementación 4. Facendo referencia a este método de complementación xenética entre especies, o xene foi denominado en inglés "Excision repair cross-complementing 4", de onde proceden as siglas ERCC4 A outra denominación, XPF, fai referencia ao xeroderma pigmentoso.
O xene ERCC4 humano codifica a proteína XPF de 916 aminoácidos cunha masa molecular duns 104 000 daltons.
Xenes similares a ERCC4 con funcións equivalentes (ortólogos) encóntranse noutros xenomas eucariotas. Algúns dos xenes ortólogos máis estudados son RAD1 do lévedo de xemación Saccharomyces cerevisiae e rad16+ no lévedo de fisión de Schizosaccharomyces pombe.
Proteína
miniatura|Figura 1: Diagrama de XPF que mostra un dominio de helicase inactivo, un dominio de nuclease e un dominio hélice-forquita-hélice.
Unha molécula de XPF e outra de ERCC1 únense para formar o heterodímero ERCC1-XPF, que é a forma de nuclease activa do encima. No heterodímero ERCC1–XPF, o ERCC1 media interaccións co ADN e proteína-proteína. O XPF proporciona o sitio activo da endonuclease e está implicado na unión ao ADN e interaccións proteína-proteína adicionais.
A proteína ERCC4/XPF consta de dúas áreas conservadas separadas por unha rexión menos conservada. A área N-terminal ten homoloxía con varios dominios conservados de ADN helicases que pertencen á superfamilia II, aínda que XPF non é unha ADN helicase. A rexión C-terminal de XPF inclúe os residuos do sitio activo para a actividade de nuclease. (Figura 1).
A maior parte da proteína ERCC1 está relacionada a nivel de secuencia co C-terminal da proteína XPF, pero carece dos residuos do dominio de nuclease. Hai un dominio de unión ao ADN "hélice-forquita-hélice" no C-terminal de cada proteína.
Pola súa secuencia primaria e similitude estrutural, a nuclease ERCC1-XPF é membro dunha ampla familia de ADN nucleases específicas de estrutura compostas por dúas subunidades, entre as cales está, por exemplo, a nuclease MUS81-EME1.
Nuclease específica de estrutura
miniatura|Figura 2: Substratos de ADN da nuclease ERCC1-XPF.
O complexo ERCC1–XPF é unha endonuclease específica de estrutura. O ERCC1-XPF só corta o esqueleto fosfodiéster do ADN especificamente nas unións entre o ADN de dobre febra e de febra simple. Introduce un corte no ADN de dobre febra no lado 5′ desa unión, a uns dous nucleótidos de distancia. (Figura 2). Esta especificidade de estrutura foi inicialmente demostrada para RAD10-RAD1, os ortólogos nos lévedos de ERCC1 e XPF.
Os motivos hidrófobos hélice–forquita–hélice nas rexións C-terminais de ERCC1 e XPF interaccionan promovendo a dimerización das dúas proteínas. Non hai actividade catalítica en ausencia de dimerización. Aínda que o dominio catalítico está incluído en XPF, e ERCC1 é cataliticamente inactivo, o ERCC1 é indispensable para a actividade do complexo.
Propuxéronse varios modelos para explicar a unión de ERCC1–XPF ao DNA, baseados en estruturas parciais de fragmentos de proteínas relevantes a resolución atómica. A unión ao ADN mediada polos dominios hélice-forquita-hélice de ERCC1 e dominios XPF sitúa o heterodímero nas zonas de unión entre o ADN de dobre febra e de febra simple.
Reparación por escisión de nucleótidos
Durante a reparación por escisión de nucleótidos, varios complexos proteicos cooperan para recoñecer o ADN danado e separan localmente a hélice do ADN durante unha curta distancia a ambos os lados do sitio do dano no ADN. A nuclease ERCC1–XPF fai unha incisión na febra de ADN danado no lado 5′ da lesión. Durante a reparación por escisión de nucleótidos, a proteína ERCC1 interacciona coa proteína XPA para coordinar a unión entre o ADN e a proteína.
Reparación de roturas de dobre febra
As células de mamíferos con ERCC1–XPF mutantes son moderadamente máis sensibles que as células normais a axentes (como as radiacións ionizantes) que causan roturas de dobre febra no ADN. As vías particulares da reparación por recombinación homóloga e por unión de extremos non homólogos dependen da función de ERCC1-XPF. A actividade relevante de ERCC1–XPF para ambos os tipos de reparación de roturas de dobre febra é a súa capacidade de eliminar as colas de febra simple 3' non homólogas dos extremos do ADN antes de volver unilas. Esta actividade é necesaria durante unha subvía de annealing de febra simple da recombinación homóloga. O podado da cola de febra simple 3' é tamén necesaria nunha subvía con mecanismo distinto de unión de extremos non homólogos, dependente das proteínas Ku. A integración homóloga do ADN, unha importante técnica para a manipulación xenética, é dependente da función de ERCC1-XPF na célula hóspede.
Reparación de enlaces cruzados entre febras do ADN
As células de mamíferos que portan mutacións en ERCC1 ou XPF son sensibles especificamente a axentes que causan a formación de enlaces cruzados entre as febras do ADN. Os enlaces cruzados entre febras do ADN bloquean a progresión da replicación do ADN, e as estruturas que quedan bloqueadas nas forcadas de replicación do ADN proporcionan substratos para a clivaxe feita por ERCC1-XPF. As incisións poden facerse a ambos os lados dos enlaces cruzados nunha febra de ADN para desfacer os enlaces cruzados e iniciar a reparación. Alternativamente, pode facerse unha rotura de dobre febra no ADN preto de enlaces cruzados entre febras, e a subseguinte reparación de recombinación homóloga pode implicar a acción da ERCC1-XPF. Aínda que non é a única nuclease implicada, o ERCC1–XPF é necesario para a reparación de enlaces cruzados entre febras durante varias fases do ciclo celular.
Importancia clínica
Xeroderma pigmentoso
Algúns individuos coa rara síndrome hereditaria xeroderma pigmentoso teñen mutacións en ERCC4. Estes pacientes son clasificados como grupo de complementación F do xeroderma pigmentoso (XP-F). As características de diagnóstico do xeroderma pigmentoso son: pel escamenta seca, pigmentación anormal da pel en áreas expostas ao sol e grave fotosensibilidade, acompañada por unha multiplicación por 1000 do risco de desenvolver cancros de pel inducidos pola radiación ultravioleta.
Síndrome de Cockayne
A maioría dos pacientes XP-F mostran síntomas moderados de xeroderma pigmentoso, pero uns poucos mostran os síntomas adicionais da síndrome de Cockayne. Os pacientes de síndrome de Cockayne presentan fotosensibilidade e desenvolven síntomas e defectos neurolóxicos.
As mutacións no xene ERCC4 poden orixinar a rara síndrome XF-E. Estes pacientes teñen características de xeroderma pigmentoso e de síndrome de Cokayne, así como síntomas adicionais neurolóxicos, hepatobiliares, musculoesqueléticos e hematopoéticos.
Anemia de Fanconi
Varios pacientes humanos con síntomas de anemia de Fanconi teñen mutacións que a causan no xene ERCC4. A anemia de Fanconi é unha doenza complexa, principalmente con síntomas hematopoéticos. Unha distinción característica da anemia de Fanconi é a hipersensibilidade a axentes que causan enlaces cruzados entre as febras do ADN. Os pacientes de anemia de Fanconi con mutacións en ERCC4 foron clasificados como pertencentes ao grupo de complementación P da anemia de Fanconi (FANCP).
ERCC4 (XPF) no colon normal miniatura|500px|Cortes secuenciais da mesma cripta do colon con tinguidura inmunohistoquímica (marrón) mostrando unha expresión alta normal das proteínas de reparación do ADN PMS2 (A), ERCC1 (B) e ERCC4 (XPF) (C). Esta cripta procede da biopsia dun paciente masculino de 58 anos que nunca tivo unha neoplasia de colon e a cripta ten unha alta expresión destas proteínas de reparación do ADN nos núcleos das células absorbentes na maioría ds criptas. Nótese que a expresión de PMS2 e ERCC4 (XPF) (nos paneis A e C) está reducida ou ausente nos núcleos de células na parte superior da cripta e dentro da superficie do lume do colo entre as criptas. A imaxe orixinal tamén foi publicada.
O ERCC4 (XPF) exprésase normalmente a alto nivel nos núcleos celulares na superficie interna do colon (ver imaxe, panel C). A superficie interna do colon está tapizada por un epitelio columnar simple con invaxinacións. As invaxinacións denomínanse glándulas intestinais ou criptas do colon. As criptas do colon teñen forma de tubos de ensaio microscópicos de paredes grosas cun oco central ao longo do tubo (o lume da cripta). As criptas teñen unhas 75 a 110 células de longo. A reparación do ADN, que implica unha alta expresión das proteínas ERCC4 (XPF), PMS2 e ERCC1, parece ser moi activa nas criptas no epitelio do colon normal non neoplástico.
As células orixínanse na base das criptas e migran cara a arriba ao longo do eixe da cripta antes de acabar desprendéndose no lume do colon días despois. Hai 5 ou 6 células nai na base das criptas. Hai uns 10 millóns de criptas ao longo da superficie interna dun colon humano medio. Se as células nai na base da cripta expresan ERCC4 (XPF), xeralmente todos os miles de células da cripta expresan tamén ERCC4 (XPF). Isto vén indicado pola cor marrón que se ve por inmunomarcaxe de ERCC4 (XPF) en case todas as células da cripta no panel C da imaxe deste corte. Unha expresión similar de PMS2 e ERCC1 ocorre nas miles de células de cada cripta de colon normal.