A DnaG é unha ADN primase bacteriana codificada polo xene dnaG. O encima DnaG e todas as outras ADN primases, sintetiza curtas febras de oligonucleótidos de ARN durante a replicación do ADN. Estes oligonucleótidos de ARN denomínanse cebadores ou primers porque actúan como punto de partida para a síntese de ADN pola ADN polimerase III bacteriana (Pol III). A DnaG cataliza a síntese de oligonucleótidos que constan de 10 a 60 nucleótidos (a unidade fundamental dos ácidos nucleicos); porén, a maioría dos oligonucleótidos sintetizados son de 11 nucleótidos de longo. A DnaG é importante na replicación do ADN bacteriano porque a ADN polimerase non pode iniciar a síntese dunha febra de ADN, senón que só pode engadir nucleótidos a unha febra preexistente. A DnaG sintetiza un cebador de ARN na orixe de replicación. Este cebador serve para cebar a síntese do ADN da febra guía. Para a outra febra parental do ADN, chamada febra atrasada, a DnaG sintetiza un cebador de ARN cada poucas quilobases (kb). Estes cebadores serven como substratos para a síntese de fragmentos de Okazaki.
En Escherichia coli a DnaG asóciase por medio de interaccións non covalentes coa helicase replicativa bacteriana DnaB para realizar a súa actividade de primase, e tres proteínas de primase DnaG asócianse con cada helicase DnaB para formar o primosoma. As primases tenden a iniciar a síntese en secuencias de tres nucleótidos específicas nos moldes de ADN monocatenario e para a DnaG de E. coli a secuencia é 5'-CTG-3'.
A DnaG contén tres dominios proteicos separados: un dominio de unión ao cinc, un dominio de ARN polimerase e un dominio dun ión á helicase DnaB. Varias especies de bacterias usan a ADN primase DnaG, entre elas Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus e Mycobacterium tuberculosis. A DnaG de E. coli ten un peso molecular de 60 quilodaltons (kDa) e contén 581 aminoácidos.
Función miniatura|A DnaG (ADN primase) é un encima esencial que intervén na forquita de replicación do ADN. miniatura|Mecanismo orgánico da síntese de oligonucleótidos de ARN en dirección 5'-3'.
A DnaG cataliza a síntese de oligonucleótidos en cinco pasos: unión ao molde, unión de nucleósido trifosfato (NTP), iniciación, extensión para formar un cebador, e transferencia do cebador á ADN polimerase III. A DnaG realiza esta catálise preto da forquita de replicación que foma a helicase DnaB durante a replicación do ADN. A DnaG debe formar un complexo con DnaB para catlizar a formación dos cebadores oligonucleótidos.
O mecanismo para a síntese do cebador polas primases implica dous sitios de unión a NTP na proteína primase (DnaG). Antes da unión dun NTP para formar o cebador de ARN, a secuencia molde de ADN monocatenario únese á DnaG. O ADN monocatenario contén unha secuencia de recoñecemento de tres nucleótidos que recruta os NTPs segundo o apareamento de bases de Watson e Crick. Despois de unirse ao ADN, a DnaG debe unirse a dous NTPs para xerar un complexo cuaternario encima-ADN-NTP-NTP. A constante de Michaelis (km) para os NTPs varía dependendo da primase e dos moldes. Os dous sitios de unión de NTP na DnaG denomínanse sitio de iniciación e sitio de elongación. O sitio de iniciación é o sitio no que se une o NTP que se incorpora ao extremo 5' do cebador. No sitio de elongación únese o NTP que se engade ao extremo 3' do cebador.
Unha vez que se uniron os dous nicleótidos á primase, a DnaG cataliza a formación dun dinucleótido formando un enlace fosfodiéster por síntese de deshidratación entre o hidroxilo 3' do nucleótido do sitio de iniciación e o fosfato α do nucleótido do sitio de elongación. Esta reacción ten como resultado a formación dun dinucleótido e a rotura do enlace entre os fósforos α e β, liberándose pirofosfato. Esta reacción é irreversible porque o pirofosfato que se forma é hidrolizado dando dúas moléculas de fosfato inogánico pola acción do encima pirofosfatase inorgánica. Esta reacción de síntese do dinucleótido é a mesma reacción que usan outros encimas que catalizan a formación do ADN e ARN (ADN polimerase, ARN polimerase); polo tanto, a DnaG debe sempre sintetizar oligonucleótidos en dirección 5'-3'. En E. coli os cebadores empezan cun dinucleósido trifosfato de adenina-guanina (pppAG) no extremo 5'.
Para que se produza unha maior elongación do dinucleótido, o oligonucleótido debe moverse para que o NTP 3' se transfira desde o sitio de elongación ao sitio de iniciación, o que permite que se una outro NTP so sitio de elongación e se enlace ao hidroxilo 3' do oligonucleótido. Unha vez que se sintetizou un oligonucleótido de lonxitude apropiada desde o paso de elongación da síntese de cebador, a DnaG transfire o cebador acabado de sintetizar á ADN polimerase III para que sintetice a febra guía do ADN ou fragmentos de Okazaki para a febra atrasada. O paso limitante da síntese do cebador ocorre despois da unión do NTP pero antes ou durante a síntese do dinucleótido.
Estrutura A primase DnaG de E. coli é unha proteína monómera de 581 residuos de aminoácidos con tres dominios funcionais, segundo estudos de proteólise. Hai un dominio de unión ao Zn N-terminal (residuos 1–110) no que o ión cinc ten coordinación tetraédrica entre unha histidina e tres residuos de cisteína, o que xoga un papel no recoñecemento de secuencias específicas de sitios de unión ao ADN. O dominio central (residuos 111–433) presenta actividade de ARN polimerase, e é o sitio da síntese do cebador de ARN. O dominio C-terminal (residuos 434–581) é responsable da unión non covalente da DnaG á proteína helicase DnaB.
Dominio de unión ao cinc miniatura|Esquerda: Estrutura do dominio de unión ao cinc de Bacillus stearothermophilus, cos residuos conservados hidrófobos e básicos mostrados en cor prateada. Dereita: Imaxe aumentada do sitio de unión ao cinc mostrando as Cys40, Cys61, Cys64 e His43 coordinando o ión cinc. Diagrama obtido de PDB 1D0Q.
O dominio de unión ao cinc é o responsable do recoñecemento dos sitios de unión ao ADN específicos de secuencia e está conservado en todas as ADN primases de bacteriófagos e outros virus, e nas de procariotas e eucariotas. O cominio de unión ao cinc da primase forma parte da subfamilia de dominios de dedos de cinc coñecidos como fita de cinc. Os dominio de dedo de cinc caracterízanse por ter dous bucles en forquita β. Os dominios de fita de cinc pensábase que carecían de hélices α, o que os distinguía doutros dominios de dedo de cinc. Porén, no ano 2000 conseguiuse cristalizar o dominio de dedo de cinc da DnaG de Bacillus stearothermophilus revelando que o dominio consistía en cinco follas β antiparalelas respecto a catro hélices α e unha hélice 310 no extremo C-terminal do dominio.
O sitio de unión ao cinc de B. stearothermophilus consta de tres residuos de cisteína, Cys40, Cys61 e Cys64 e un resiudo de histidina, His43. A Cys40 e a His43 están localizadas na forquita β entre a segunda e a terceira folla β. A Cys61 está localizada na quinta folla β, e a Cys64 na forquita β entre a cuarta e a quinta folla β. Esres catro residuos teñen coordinación tetraédrica co ión cinc. O ión Zn2+ crese que estabiliza os bucles entre a segunda e a terceira folla β así como a cuarta e a quinta folla β. O dominio está ademais estabilizado por varias interaccións hidrofóbicas entre a superficie interna hidrófoba da folla β que está empaquetada contra a segunda e terceira hélice α. A superficie exterfna da folla β tamén ten moitos residuos hidrófobos e básicos conservados. Estes residuos son: Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 e Phe62.
Unión ao ADN
Pénsase que a función do dominio de unión ao cinc é o recoñecemento do ADN específico de secuencia. As ADN primases fabrican cebadores de ARN que se usarán para a síntese de ADN. A situación dos cebadores de ARN non é ao chou, o que suxire que están situados en secuencias de ADN específicas. De feito, outras ADN primases recoñecen secuencias triplete; a secuencia específica recoñecida por B. stearothermophilus aínda non se identificou. Atopouse que se os residuos de cisteína que coordinan o ión cinc mutan, a ADN primase deixa de funcionar. Isto indica que o dominio de unión ao cinc xoga un papel no recoñecemento de secuencia. Ademais, a superficie hidrófoba da folla β, xunto cos residuos básicos que están agrupados principalmente nun bordo da folla, serven para atraer o ADN monocatenario, o que facilita a unión ao ADN.
Baseándose en estudos previos da unión ao ADN de ADN primases, pénsase que o ADN únese ao dominio de dedo de cinc pola superficie da folla β, e os tres nucleótidos únense polas tres febras da folla β. Os residuos cargados positivamente da folla poderían formar contactos cos fosfatos, e os residuos aromáticos formarían interaccións de empillamento coas bases. Este é o modelo de unión ao ADN do dominio de unión ao ADN monocatenario da proteína da replicación A (RPA). É lóxico asumir que o dominio de unión ao cinc de B. stearothermophilus se une ao ADN de xeito similar, xa que os residuos importantes para unión ao ADN da RPA aparecen en posicións equivalentes estruturalmente en B. stearothermophilus.
Dominio de ARN polimerase miniatura|Estrutura do dominio de ARN polimerase da DnaG de E. coli. Os residuos básicos altamente conservados Arg146, Arg221 e Lys229 móstranse en amarelo. Esta imaxe obtívose de PDB 1DD9.
Como suxire o seu nome, o dominio de ARN polimerase da DnaG é responsable da sintetizar os cebadores de ARN sobre o ADN monocatenario. In vitro a DnaG pode sintetizar fragmentos de cebadores de ata 60 nucleótidos de lonxitude, pero os fragmentos de cebadores in vivo están limitados a aproximadamente 11 nucleótidos. Durante a síntese da febra atrasada a DnaG sintetiza entre 2000 e 3000 cebadores a unha velocidade dun cebador por segundo.
O dominio de ARN polimerase da DnaG ten tres subdominios, o subdominio N-terminal, que ten un pregamento mixto α e β, o subdominio central, que consta dunha folla β de 5 febras e 6 hélices α, e o subdominio C-terminal, que está constituído por un feixe de hélices que comprende 3 hélices α antiparalelas. O dominio central está feito en parte do pregamento toprim, un pregamento que foi observado en moitas proteínas fosfotransferases que se unen a metais. O subdominio central e o N-terminal forman unha fenda pouco profunda, que constitúe o sitio activo da elongación da cadea de ARN na DnaG. A apertura da fenda está tapizada por varios residuos básicos moi conservados: Arg146, Arg221 e Lys229. Estes residuos forman parte da crista electrostaticamente positiva do subdominio N-terminal. Esta crista é a que interacciona co ADN monocatenario e axuda a guialo á fenda, a cal consta dun centro para a unión do metal do motivo toprim no subdominio central, e os motivos de primase conservados do subdominio N-terminal. O sitio de unión ao metal do motivo toprim é onde se sintetiza o cebador. O dúplex ARN:ADN sae despois por outra depresión básica.
Dominio C-terminal miniatura|A estrutura do dominio de unión á helicase de E. coli. Obtido de PDB 2R6A. As dúas hélices inferiores forman a forquita helicoidal do subdominio C2. As restantes cinco hélices forman o feixe de hélices do subdominio C1.
A diferenza dos dominios de unión ao cinc e os dominios de ARN polimerase, os dominos C-terminais das ADN primases non están conservados. En primases de procariotas a única función coñecida deste dominio é interaccionar coa helicase, DnaB. Así, este dominio denomínase dominio de unión á helicase (HBD). O HBD da DnaG consta de dous subdominios: un feixe de hélices (subdominio C1) e unha forquita helicoidal (subdominio C2). En cada unha das tres moléculas de DnaG que se une ao hexámero DnaB, os subdominios C1 dos HBDs interaccionan coa DnaB nos seus dominios N-terminais sobre a superficie interna do anel hexámero, mentres que os subdominios C2 interaccionan cos dominios N-terminais sobre a superficie externa do hexámero.