miniatura|O anticorpo monoclonal ibritumomab conxugado co tiuxetan. A bioconxugación é o establecemento de enlaces covalentes estables entre dúas moléculas, das cales polo menos unha é unha biomolécula. Os métodos para conxugar biomoléculas aplícanse en varios eidos da medicina, diagnóstico, biocatálise e ciencias de materiais. As biomoléculas modificadas sinteticamente poden ter diversas funcionalidades, como rastrear eventos celulares, revelar a función de encimas, determinar a biodistribución de proteínas, crear biomarcadores específicos para obter imaxes, e entregar fármacos a células diana.
A bioconxugación é unha estratexia fundamental que serve para enlazar estas biomoléculas modificadas con diferentes substratos. Ademais das aplicacións en investigación biomédica, a importancia da bioconxugación aumentou recentemente tamén en nanotecnoloxía, como nos puntos cuánticos bioconxugados.
Os tipos máis comúns de bioconxugación son acoplar unha pequena molécula (como a biotina ou unha tinguidura fluorescente) a unha proteína. Os conxugados anticorpo-fármaco como o Brentuximab vedotina e Gemtuzumab ozogamicina son exemplos que entran dentro desta categoría. Outras moléculas menos comúns usadas en bioconxugación son os oligosacáridos, ácidos nucleicos, polímeros sintéticos como o polietilenglicol, e nanotubos de carbono. As conxugacións proteína-proteína, como o acoplamento dun anticorpo a un encima, ou a ligazón de complexos proteicos, é tamén facilitado por bioconxugacións.
Reaccións de bioconxugación comúns A síntese de bioconxugados supón diversos retos, que van desde o uso simple e non específico dun marcador fluorescente a un deseño complexo de conxugados anticorpo-fármaco. Desenvolvéronse varias reaccións de bioconxugación para modificar quimicamente proteínas. Os tipos comúns de reaccións de bioconxugación de proteínas son o acoplamento a residuos de aminoácidos lisina, cisteína e tirosina, así como a modificación de residuos de triptófano e dos extremos N- e C-terminal.
Porén, estas reaccións a miúdo carecen de quimioselectividade e eficiencia, porque dependen da presenza de aminoácidos nativos, que por estaren presentes en grandes cantidades, dificultan a selectividade. Hai unha crecente necesidade de estratexias químicas que sirvan para unir moléculas sintéticas a sitios específicos de proteínas. Unha estratexia é instalar primeiro un grupo funcional particular nunha proteína, e despois utilízase unha reacción bioortogonal para acoplar unha biomolécula con ese grupo funcional particular. As reaccións bioortogonais que teñen como diana os grupos funcionais non nativos utilízanse amplamente en química de bioconxugación. Algunhas importantes reaccións son modificacións de cetonas e aldehidos, a ligazón de Staudinger con azidas orgánicas, a cicloadición de Huisgen de azidas catalizadas por cobre, e a cicloadición de Huisgen de azidas promovida pola tensión.
En aminoácidos naturais
Reaccións das lisinas
O residuo de lisina nucleófila é comunmente o sitio diana na bioconxugación de proteínas, por medio de ésteres N-hidroxisuccinimidil (NHS) reactivos a aminas. Para obter un número óptimo de residuos de lisina desprotonados, o pH da solución acuosa debe estar por debaixo do pKa do grupo amonio da lisina, que é de aproximadamente 10,5, así que o pH típico da reacción é de arredor de 8 e 9. O reactivo común para a reacción de acoplamento é un éster de NHS (mostrado na primeira reacción de abaixo na Figura 1), que reacciona coa lisina nucleófila por un mecanismo de acilación da lisina. Outros reactivos similares son os isocianatos e isotiocianatos que usan un mecanismo similar (mostrado na segunda e terceira reaccións na Figura 1 de abaixo). Como alternativa aos reactivos específicos da lisina usados clasicamente, propuxéronse recentemente os fluoruros de benzoílo (mostrado na última reacción de abaixo da Figura 1), o que permite a modificación da lisina de proteínas en condicións suaves (baixa temperatura, pH fisiolóxico).
miniatura|center|Figura 1. Estratexias de bioconxugación para residuos de lisina.|409x409px
Reaccións de cisteínas Como as cisteínas libres raramente aparecen na superficie dunha proteína, son unha elección excelente para a modificación quimioselectiva. En condicións básicas, os residuos de cisteína serán desprotonados para xerar un nucleófilo tiolato, que reacciona con electrófilos suaves, como as maleimidas e as iodoacetamidas (mostradas nas dúas primeiras reaccións na Figura 2 de abaixo). Como resultado, fórmase un enlace carbono-xofre. Outra modificación de residuos de cisteína supón a formación dun enlace disulfuro (mostrada na terceira reacción da Figura 2). Os residuos de cisteína reducidos reaccionan con disulfuros exóxenos, xerando un enlace disulfuro novo na proteína. A miúdo úsase un exceso de disulfuros para impulsar a reacción, como a 2-tiopiridona e 3-carboxi-4-nitrotiofenol. Demostrouse que os alquinos deficientes en electróns reaccionan selectivamente con residuos de cisteína de proteínas en presenza doutros residuos de aminoácidos nucleófilos. Dependendo da substitución dos alquinos, estas reaccións poden producir bioconxugados clivables (cando se usan derivados de alquinonas), ou ben estables hidroliticamente (cando se usan 3-arilpropiolonitrilos; a última reacción da abaixo na Figura 2).
miniatura|center|Figura 2. Estratexias de bioconxugación para residuos de cisteína.|409x409px
Reaccións de tirosinas Os residuos de tirosina son relativamente non reactivos; polo tanto, non foron dianas moi utilizadas para a bioconxugación. Desenvolvementos recentes mostraron que a tirosina pode modificarse por medio de reaccións de substitución aromática electrófila, e é selectiva para o carbono aromático adxacente ao grupo hidroxilo fenólico. Isto é especialmente útil no caso de residuos de cisteína que non poden ser atacados. Concretamente, o diazonio acóplase con residuos de tirosina (o sal de diazonio móstrase como reactivo na primeira reacción na Figura 3 de abaixo), e un substituínte de retirada electrónica na posición 4 do sal de diazonio pode incrementar a eficiencia da reacción. Sinaláronse os derivados cíclicos diazodicarboxiamida como o 4-fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) para a bioconxugación selectiva en residuos de tirosina (a segunda reacción na Figura 3 de abaixo). Unha reacción tipo Mannich de tres compoñentes con aldehidos e anilinas (a última reacción na Figura 3) tamén foi descrita como relativamente selectiva para a tirosina baixo unhas condicións de reacción suaves optimizadas.
miniatura|center|Figura 3. Estratexias de bioconxugación para residuos de tirosina.|409x409px
Reaccións dos N- e C-terminais Como os residuos de aminoácidos naturais están habitualmente presentes en grandes cantidades, a miúdo é difícil modificar un só sitio. Desenvolvéronse estratexias que atacan os extremos (terminais) das proteínas, porque melloran moito a selectividade do sitio de modificación da proteína. Unha das modificacións N-terminais consiste na funcionalización do aminoácido terminal. A oxidación dos residuos N-terminais de serina e treonina pode xerar aldehidos N-terminais, os cales poden sufrir reaccións biortogonais (mostrada na primeira reacción na Figura 4). Outro tipo de modificación implica a condensación da cisteína N-terminal con aldehidos, xerando tiazolidina, que é estable a pH alto (segunda reacción da Figura 4). Usando o piridoxal fosfato (PLP), varios aminoácidos N-terminais pode sufrir unha transaminación para render un aldehido N-terminal, como a glicina e o ácido aspártico (terceira reacción da Figura 4).
miniatura|center|Figura 4. Estratexias de bioconxugación para o N-terminal|307x307px
Un exemplo de modificación C-terminal é a ligazón química negativa, que é o acoplamento entre o tioéster C-terminal e a cisteína N-terminal (Figura 5).
miniatura|center|Figura 5. Estratexias de bioconxugación para o C-terminal.|527x527px
Reaccións biortogonais: sobre grupos funcionais particulares Modificación de cetonas e aldehidos Pode facerse que unha cetona ou aldehido se una a unha proteína por medio da oxidación de residuos de serina N-terminais ou transaminación con PLP. Adicionalmente, poden introducirse incorporando aminoácidos non naturais polo método de Tirrell ou o de Schultz. Despois condénsanse selectivamente cunha alcoxiamina e unha hidrazina, producindo derivados de hidrazona e oximas (mostrados na primeira e segunda reaccións, respectivamente, da Figura 6). Esta reacción é moi quimioselectiva en canto á bioconxugación da proteína, mais a velocidade de reacción é lenta. Os estudos mecanísticos mostran que o paso limitante da velocidade é a deshidratación dun intermediario tetraédrico, así que se adoita empregar unha solución debilmente ácida para acelerar o paso de deshidratación.
miniatura|center|Figura 6. Estratexias de bioconxugación para cetonas e aldehidos.|410x410px
A introdución de catalizadores nucleófilos pode aumentar significativamente a velocidade da reacción (mostrada na Figura 7). Por exemplo, usando a anilina como catalizador nucleófilo, un carbonilo protonado menos poboado convértese nunha base de Schiff protonada moi poboada. Noutras palabras, xérase unha alta concentración de electrófilo reactivo. A ligazón de oximas pode entón ocorrer doadamente, e informouse que a velocidade aumenta multiplicándose ata por 400 en condicións ácidas suaves. A clave deste catalizador é que pode xerar un electrófilo reactivo sen competir co produto desexado.
miniatura|center|Figura 7. Catálise nucleófila de ligazón de oximas.|421x421px
Desenvolvementos recentes que aproveitan os grupos funcionais proximais permitiron facer condensacións de hidrazonas para operar a 20 M−1s−1 a pH neutro mentres que as condensacións de oximas proceden a 500-10000 M−1s−1 a pH neutro sen engadir catalizador.
Ligazón de Staudinger con azidas
A ligazón de Staudinger de azidas e fosfina utilizouse amplamente no campo da química biolóxica. Dado pode formar un enlace amida estable nas células vivas, aplicouse á modificación da membrana plasmática, así como na obtención de imaxes in vivo e noutros estudos de bioconxugación.
miniatura|center|Figura 8. Ligazón de Staudinger con azidas|500x500px
A diferenza da reacción de Staudinger clásica, a ligaxón de Staudinger é unha reacción de segunda orde na cal o paso limitante da velocidade é a formación de fosfazida (mecanismo de reacción específico mostrado na Figura 9). Primeiro, a trifenilfosfina reacciona coa azida para render un azailuro por medio dun estado de transición dun anel de catro membros, e despois unha reacción intramolecular orixina un intermediario iminofosforano, que despois dará a ligazón amida por hidrólise.
miniatura|Figura 9. Mecanismo da ligazón de Staudinger.|center|565x565px
Ciclación de Huisgen de azidas
Ciclación de Huisen de azidas catalizada polo cobre As azidas convertéronse nunha diana común na modificación quimioselectiva de proteínas, porque son de tamaño pequeno e teñen un potencial de reacción termodinámica favorable. Unha desas reaccións de azidas é a reacción de cicloadición [3+2] con alquinos, pero para que se produza a reacción cómpren altas temperaturas e a miúdo orixina mesturas de rexioisómeros.
center|miniatura|Figura 10. Ciclación de azidas catalizada por cobre.|460x460px
Unha reacción mellorada desenvolvida polo químico Karl Barry Sharpless utiliza como catalizador o cobre(I), que acopla as azidas con alquinos terminais, que só dá lugar a 1,2,3 triazois 1,4 substituídos con rendementos altos (mostrada máis abaixo na Figura 11). O estudo do mecanismo suxire unha reacción en varios pasos. O Cu(I) acóplase primeiro con acetilenos, e despois reacciona coa azida para xerar un intermediario de seis membros. O proceso é tan robusto que ocorre a pHs que van de 4 a 12, e adoita utilizarse o sulfato de cobre(II) como catalizador en presenza dun axente redutor.