Lo smistamento o selezione cellulare (Cell sorting) è il processo mediante il quale uno specifico tipo di cellula viene selezionato tra altri contenuti di un campione sulla base di proprietà fisiche o biologiche quali dimensioni, parametri morfologici, vitalità ed espressione proteica extracellulare e intracellulare. La popolazione cellulare omogenea che si ottiene è utile in varie applicazioni di ricerca, diagnosi e terapia.
Metodi I metodi di smistamento cellulare si dividono principalmente in due categorie: selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e selezione cellulare immunomagnetica. Tuttavia, grazie a molti anni di perfezionamento e alla domanda in crescita, i ricercatori stanno lavorando allo sviluppo di dispositivi di smistamento microfluidico che presentano numerosi vantaggi rispetto alla tipica selezione cellulare.
Attivata dalla fluorescenza
La selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), nota anche come smistamento cellulare mediante citometria a flusso, è un marchio registrato dalla Becton Dickinson and Company. Questa tecnica utilizza la citometria a flusso per smistare le cellule in base a parametri morfologici e all'espressione di diverse proteine extracellulari e intracellulari. Il metodo consente la separazione cellulare multiparametrica e prevede l'incapsulamento delle cellule in goccioline liquide che vengono selettivamente caricate elettricamente e separate mediante un campo elettrico esterno. La citometria a flusso si avvale di diversi sistemi che lavorano in sinergia per ottenere uno smistamento efficace per eventi di interesse. Sono inclusi sistemi fluidici, ottici ed elettrostatici. Il sistema fluidico deve stabilire un preciso distacco temporizzato dal flusso liquido in piccole gocce uniformi, così che le gocce contenenti singole cellule possano poi essere deflesse elettrostaticamente. Secondo l'invenzione di Richard Sweet, la formazione di gocce del getto liquido di un separatore di cellule viene stabilizzata dalle vibrazioni di un trasduttore ultrasonico all'uscita. Le perturbazioni crescono esponenzialmente e portano alla frammentazione del getto in gocce con una temporizzazione precisa. Una cellula di interesse da selezionare verrà misurata nella zona di rilevamento e poi si sposterà lungo il flusso fino al punto di distacco. Durante la separazione della goccia con la cellula all'interno dal getto intatto, viene dato un impulso di tensione al getto liquido affinché le gocce contenenti le cellule di interesse possano essere deflesse nel campo elettrico creato tra le due piastre di deflessione per la selezione. Le gocce vengono quindi raccolte da tubi o vasche di raccolta posti sotto le piastre di deflessione. La citometria a flusso con selezione cellulare offre un'elevatissima specificità per uno o più marcatori di superficie, ma è limitata nel numero di cellule che possono essere processate durante una giornata lavorativa. Per questo motivo, spesso viene considerato il pre-arricchimento della popolazione di interesse mediante selezione cellulare immunomagnetica, soprattutto quando le cellule di interesse sono relativamente rare e si devono processare grandi lotti di cellule. Inoltre, i citometri a flusso con smistamento cellulare sono strumenti complessi che vengono generalmente utilizzati solo da personale ben addestrato in strutture di citometria a flusso o laboratori ben attrezzati e, poiché sono normalmente di grandi dimensioni, non è sempre possibile collocarli all'interno di una cappa di sicurezza biologica. Pertanto, non è sempre possibile garantire la sterilità del campione e, siccome i sistemi fluidici possono essere puliti ma non sono monouso, esiste la possibilità di contaminazione incrociata tra i campioni. Un altro aspetto da considerare è che, quando si utilizzano campioni infetti, la generazione di goccioline all'interno dello strumento potrebbe portare alla formazione di aerosol pericolosi per l'operatore. Queste ultime considerazioni sono di particolare importanza nelle applicazioni cliniche, come la terapia cellulare, che devono essere eseguite in conformità alle Norme di buona fabbricazione (GMP). I ricercatori hanno a disposizione una varietà di coloranti fluorescenti per progettare pannelli multicolore e ottenere separazioni simultanee ed efficaci di più tipi cellulari ben definiti. Il diagramma A mostra la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per la selezione negativa delle cellule (rimozione del gruppo indesiderato) e il diagramma B mostra la FACS per la selezione positiva delle cellule (selezione del gruppo desiderato).
Coloranti fluorescenti nello smistamento cellulare I coloranti fluorescenti agiscono in modi diversi. Generalmente, un colorante fluorescente viene eccitato da una sorgente luminosa ad una certa lunghezza d'onda ed emette luce ad energia inferiore e lunghezza d'onda maggiore. I coloranti più comuni agiscono legandosi agli antigeni presenti sulle cellule. Gli antigeni bersaglio più comuni sono i Cluster di differenziazione (CD). Sono specifici per un certo tipo di cellula. Se si identifica il CD presente sulle cellule di interesse, è possibile colorare il campione con un colorante fluorescente specifico e utilizzare la citometria a flusso per separare la popolazione di interesse. I coloranti fluorescenti possono agire tramite svariati meccanismi.
Alcuni coloranti sono in grado di diffondersi attraverso la membrana cellulare. Sfruttando questa proprietà, è possibile caratterizzare l'attività intracellulare e l'espressione superficiale delle proteine. Ad esempio, nelle cellule morte, lo ioduro di propidio (PI) può penetrare nel nucleo e legarsi al DNA. Il segnale di fluorescenza del PI può essere utilizzato per quantificare il contenuto di DNA ai fini dell'analisi del ciclo cellulare o per identificare cellule morte in un campione.
Alcuni coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per caratterizzare l'attività cinetica intracellulare senza fissare le cellule in formaldeide, con conseguente perdita di cellule vitali.
La tabella seguente elenca i coloranti che possono essere utilizzati per misurare diversi parametri di citotossicità da stress ossidativo. Colorante Parametro Meccanismo d'azione Eccitazione/Emissione DCFH-DA Specie reattive dell'ossigeno (ROS) Deacetilato in 2,7-diclorofluoresceina, che in presenza di radicali reagisce con i ROS trasformandosi in 2,7-diclorofluoresceina (DCF) 488 nm/525 nm Rh123 Potenziale di membrana mitocondriale (MMP) Viene sequestrato dai mitocondri attivi 488 nm/525 nm Indo-1 AM Concentrazione di calcio Emette a due diverse lunghezze d'onda in base alla presenza di ioni calcio 350 nm/[400 nm/485 nm] PI Cellule vive o morte Penetra solo le cellule morte e si lega al DNA 488 nm/675 nm Questo tipo di esperimento è solo un esempio delle potenzialità della citometria a flusso. Nei sistemi FACS, le cellule caratterizzate possono poi essere selezionate e purificate per ulteriori esperimenti.
Selezione immunomagnetica delle cellule
MACS
La selezione cellulare immunomagnetica, è nota anche come arricchimento cellulare immunomagnetico o selezione cellulare attivata magneticamente, generalmente detta MACS, marchio registrato di Miltenyi GmbH. Si basa sullo smistamento di microsfere che attraversano un campo magnetico. Diverse aziende offrono soluzioni differenti per l'arricchimento o la deplezione di popolazioni cellulari. La selezione cellulare immunomagnetica fornisce un metodo per arricchire una miscela eterogenea di cellule in base all'espressione delle proteine di superficie (antigeni). Si basa sul legame di piccole particelle supermagnetiche inerti ad anticorpi monoclonali (mAb) specifici per gli antigeni presenti sulla popolazione cellulare target. Le cellule marcate con i coniugati anticorpo-microsfera vengono quindi separate attraverso una colonna di separazione immersa in un campo magnetico. Le microsfere aderiscono alla matrice all'interno della colonna e le cellule che trasportano vengono trattenute. Le cellule non marcate riescono ad attraversare il campo e vengono raccolte nel flusso di eluizione. Per eluire le cellule intrappolate dalla colonna, il campo magnetico viene semplicemente rimosso. La separazione cellulare immunomagnetica consente quindi diverse strategie per arricchimento e deplezione delle cellule. Le microsfere immunomagnetiche di solito non interferiscono con i test successivi, tuttavia per alcune applicazioni potrebbe essere necessario rimuoverle. Con questo metodo, aumentare il numero di cellule non influisce significativamente sui tempi di elaborazione e si riesce a garantire la sterilità del campione eseguendo la selezione all'interno di una cappa di biosicurezza. D'altra parte, questa tecnica consente di separare le cellule in base a un solo marcatore e non riesce a discriminare tra diversi livelli di espressione proteica per un'analisi quantitativa. La selezione cellulare immunomagnetica si è dimostrata vantaggiosa in particolare con colture di cellule progenitrici neurali (NPC), poiché è più facile da gestire e causa meno danni alle cellule vive.
Le colture di NPC sono particolarmente difficili da gestire perché le cellule cerebrali vive sono sensibili e tendono a contaminarsi a vicenda. Per risultati più chiari, i laboratori necessitano di linee di NPC più pure. Uno studio condotto nel 2019 (con il supporto finanziario della New York Stem Cell Foundation e dell'Association for Frontotemporal Degeneration) ha scoperto che la selezione cellulare immunomagnetica è un modo economico e semplice per ottenere tale purezza causando danni minimi alle linee cellulari, per mantenere cellule di migliore qualità, raccogliere NPC più omogenee e aumentare le possibilità di trovare trattamenti efficaci per i disturbi neurologici. Hanno utilizzato sia il metodo immunomagnetico che quello attivato dalla fluorescenza per filtrare CD271 - (marcatori utili per le cellule staminali mesenchimali) e CD133+ (marcatori per le cellule staminali tumorali) per confrontare la vitalità in ciascun metodo.
La selezione cellulare immunomagnetica è stata utilizzata anche nell'assistenza alla riproduzione (inseminazione artificiale) e nel trattamento del trapianto di retina. Nel caso dell'assistenza alla riproduzione, gli spermatozoi apoptotici (cellule morte o danneggiate) vengono separati in modo da raccogliere ed utilizzare più spermatozoi non apoptotici (non danneggiate) e aumentare la probabilità di fertilità del soggetto. Questo tipo di trattamento si è dimostrato più efficace se eseguito ripetutamente, aumentando la quantità di cellule non apoptotiche presenti durante l'inseminazione.
Uno studio del 2018 condotto in Francia (con il supporto di numerosi individui e agenzie, tra cui: l'Institut de la Vision di Parigi e l'associazione Retina France) ha utilizzato i ratti e il metodo di selezione cellulare immunomagnetica per dimostrare che i fotorecettori (cellule della retina che rispondono alla luce) possono essere trapiantati per curare la cecità. In questo processo, le microsfere sono state attaccate all'enzima CD73 per facilitare la separazione dei PR (fotorecettori) dagli organoidi retinici. L'antigene CD73+ espresso con cellule RCVRN+ (proteine che si legano al calcio nell'occhio) ha mostrato ai ricercatori che questa combinazione di CD73+ e RCVRN+ poteva essere utilizzata con precursore post-mitotico dei PR per la riparazione. Sebbene lo studio non ne abbia potuto verificare il successo negli esseri umani, con l'abbinamento di successo di fotorecettori non danneggiati con l'antigene CD73, e il trapianto nei ratti, si sono poste le basi per ulteriori ricerche. Questo successo nella selezione e nell'accoppiamento cellulare tramite trapianto mostra promettenti prospettive per una potenziale cura delle malattie della retina, anche per la cecità totale. Ad oggi, è stata riportata solo una riparazione parziale della vista.
Dispositivi microfluidici