десно|мини|300x300пкс| Роботска подготовка на примероци од масена спектрометрија MALDI на носач на примерок. Протеомика ― истражување на белковините на голем размер. Белковините се витални делови на живите организми, со многу функции како што се образувањето на структурни влакна на мускулното ткиво, ензимско варење на храната или синтеза и репликација на ДНК. Покрај тоа, други видови на белковини вклучуваат антитела кои го штитат организмот од инфекции и хормони кои испраќаат важни сигнали низ телото.
Протеомот е целиот сет на белковинипроизведени или модифицирани од организам или систем. Протеомиката овозможува идентификација на постојано зголемување на бројот на белковини. Ова варира во зависност од времето и посебните барања, или стресови, под кои се подложува клетка или организам.
Протеомиката е меѓудисциплинарен домен кој има голема корист од генетските информации на различни проекти за геном, вклучувајќи го и Проектот за човечкиот геном. Го опфаќа истражувањето на протеомите од целокупното ниво на белковинскиот состав, структура и активност и е важна компонента на функционалната геномика.
Протеомиката претежно означува опитна анализа од големи размери на белковини и протеоми, но често се однесува конкретно на прочистување на белковините и масена спектрометрија. Навистина, масената спектрометрија е најмоќниот метод за анализа на протеомите, и во големи примероци составени од милиони клетки и во единечни клетки.
Историја и етимологија Првите студии за белковини кои би можеле да се сметаат за протеомици започнале во 1975 година, по воведувањето на дводимензионалниот гел и мапирањето на белковини од бактеријата Escherichia coli.
Зборот протеом е мешавина од зборовите „протеин“ (белковина) и „геном“. Тој бил измислен во 1994 година од тогашниот проф-др и студент Марк Вилкинс на Мекориевиот универзитет, кој ја основал првата посветена лабораторија за протеомика во 1995 година.
Сложеноста на проблемот По геномиката и транскриптомика, протеомиката е следниот чекор во проучувањето на биолошките системи. Тоа е посложено од геномиката бидејќи геномот на организмот е повеќе или помалку постојан, додека протеомите се разликуваат од клетка до клетка и од време на време. Различни гени се изразуваат во различни врсти на клетки, што значи дека дури и основниот сет на белковини произведени во клетката мора да биде идентификуван.
Во минатото овој феномен бил проценет со анализа на РНК, за која било откриено дека нема поврзаност со содржината на белковини. Сега е познато дека информациската РНК не секогаш се преведува во белковина, и количината на белковина произведен за дадена количина на информациската РНК зависи од генот од кој е транскрибиран и од физиолошката состојба на клетката. Протеомиката го потврдува присуството на белковината и дава директна мерка за неговата количина.
Послепреведувачки модификации Не само што преводот од информациската РНК предизвикува разлики, туку и многу белковини се подложени на широк спектар на хемиски модификации по преводот. Најчестите и најпроучени послепреведувачки модификации вклучуваат фосфорилација и гликозилација. Многу од овие послепреведувачки модификации се клучни за функцијата на белковината.
Фосфорилација Една таква модификација е фосфорилацијата, која им се случува на многу ензими и структурни белковини во постапката на клеточно сигнализирање. Додавањето на фосфат на одредени аминокиселини - најчесто серин и треонин со посредство на серин-треонински кинази, или поретко тирозин со посредство на тирозински кинази - предизвикува белковината да стане цел за врзување или меѓудејство со посебен сет на други белковината кои го препознаваат фосфорилираниот домен.
Бидејќи белковинската фосфорилација е една од најпроучените белковински модификации, многу „протеомски“ напори се насочени кон одредување на множеството фосфорилирани белковини во одредена клетка или ткивен вид под одредени околности. Ова го предупредува научникот за сигналните патишта кои можат да бидат активни во тој случај.
Убиквитинација Убикитин е мала белковина кој може да се прицврсти на одредени белковински супстрати со помош на ензими наречени Е3 убиквитински лигази. Утврдувањето кои белковини се поли-убиквитинираним помага да се разбере како се регулираат белковинските патишта. Според тоа, ова е дополнителна легитимна „протеомска“ студија. Слично на тоа, штом истражувачот ќе утврди кои супстрати се убиквитинирани од секоја лигаза, корисно е да се определи збирот на лигази изразени во одреден вид на клетка.
Дополнителни модификации Покрај фосфорилацијата и убиквитинацијата, белковините може да бидат подложени на (меѓу другите) метилација, ацетилација, гликозилација, оксидација и нитрозилација. Некои белковини се подложени на сите овие модификации, често во комбинации зависни од времето. Ова ја илустрира потенцијалната сложеност на проучувањето на структурата и функцијата на белковините.
Различни белковини се направени под различни околности Клетката може да направи различни групи на белковини во различно време или под различни услови, на пример за време на развој, клеточна диференцијација, клеточен циклус или канцерогенеза. Понатамошно зголемување на сложеноста на протеомот, како што е споменато, повеќето белковини се способни да подлежат на широк опсег на послепреведувачки модификации.
Затоа, студијата за протеомиката може да стане сложена многу брзо, дури и ако темата на студијата е ограничена. Во поамбициозни услови, како на пример кога се бара биомаркер за посебен подвид на рак, научникот за протеомика може да избере да проучува повеќе примероци од крвен серум од повеќе пациенти со рак за да ги минимизира збунувачките фактори и да ја земе предвид опитна бучава. Така, понекогаш се неопходни сложени опитни дизајни за да се земе предвид динамичната сложеност на протеомот.
Ограничувања на студиите за геномика и протеомика Протеомиката дава различно ниво на разбирање од геномиката поради многу причини:
нивото на транскрипција на генот дава само груба проценка на неговото „ниво на превод“ во белковина. Информациската РНК произведена во изобилство може брзо да биде разградувана или неефикасно да биде преведена, што резултира со мала количина на белковини. како што беше споменато погоре, многу белковини доживуваат „послепреведувачки модификации“ кои длабоко влијаат на нивните активности; на пример, некои белковини не се активни додека не се фосфорилираат. За проучување на послепреведувачките модификации се користени методи како што се фосфопротеомика и гликопротеомика. многу транскрипти доведуваат до повеќе од една белковина, преку алтернативно спојување или алтернативни послепреведувачки модификации. многу белковини образуваат комплекси со други белковини или молекули на РНК и функционираат само во присуство на овие други молекули. стапката на разградување на белковини игра важна улога во содржината на белковините.
Можност за размножување
Еден главен фактор што влијае на можноста заразмножување во опитите со протеомика е истовременото елуирање на многу повеќе пептиди отколку што можат да измерат масените спектрометри. Ова предизвикува стохастички разлики помеѓу експериментите поради стекнувањето на триптични пептиди зависни од податоците. Иако раните големи протеомски анализи на пушка покажаа значителна променливост помеѓу лабораториите, веројатно делумно поради техничките и опитните разлики помеѓу лабораториите, можноста за размножување е подобрена во поновата анализа на масена спектрометрија, особено на ниво на белковини. Имено, насочената протеомика покажува зголемена можност за размножување и повторливост во споредба со методите со „сачмарка“, иако на сметка на густината и ефективноста на податоците.
Квалитет на податоци
Протеомската анализа е многу подложна на автоматизација и се создаваат големи збирки податоци, кои се обработуваат со софтверски алгоритми. Параметрите на филтерот се користат за намалување на бројот на лажни погодоци, но тие не можат целосно да бидат елиминирани. Научниците ја изразиле потребата за свест дека протеомските опити треба да се придржуваат до критериумите на аналитичката хемија (доволен квалитет на податоците, проверка на разумност, валидација).
Методи на проучување на белковините Во протеомиката, постојат повеќе методи за проучување на белковините. Општо земено, белковините може да бидат забележани со користење на антитела (имуноанализи), електрофоретско раздвојување или масена спектрометрија. Ако биде анализиран сложен биолошки примерок, или треба да биде користен многу специфично антитело во квантитативната анализа на точки, или биохемиското одвојување потоа треба да се користи пред чекорот на забележување, бидејќи има премногу аналити во примерокот за да се изврши точно откривање и квантификација.
Откривање на белковини со антитела (имуноанализа) Антителата на одредени белковини или на нивните модифицирани облици се користени во биохемиските и клеточните биолошки студии. Овие се меѓу најчестите алатки што ги користат молекуларните биолози денес. Постојат неколку специфични техники и протоколи кои користат антитела за откривање на белковини. Имуносорбентната анализа поврзана со ензимот е користена со децении за откривање и квантитативно мерење на белковините во примероците. Западниот Саутернов метод може да биде користен за откривање и квантификација на поединечни белковини, каде што во почетниот чекор, сложена белковинска смеса се одвојува со помош на SDS-PAGE, а потоа белковината од интерес се идентификува со користење на антитело.
Модифицираните белковини може да бидат проучувани со развивање на антитело специфични за таа модификација. На пример, постојат антитела кои препознаваат одредени белковини само кога се тирозинско фосфорилирани, тие се познати како фосфо-специфични антитела. Исто така, постојат антитела специфични за други модификации. Тие може да бидат користени за да биде одреден збирот на белковини кои претрпеле модификација од интерес.
Имуноанализите може да се спроведат и со користење на рекомбинантно генерирани деривати на имуноглобулин или синтетички дизајнирани белковински скелиња кои се избрани за висока специфичност на антигенот. Таквите врзувачи вклучуваат фрагменти на антитела од еден домен (нанотела), дизајнирани анкиринско повторувачки белковини и аптамери.
Откривањето на болеста на молекуларно ниво ја поттикнува новата револуција на рана дијагноза и третман. Предизвик со кој се соочува оваа област е дека белковинските биомаркери за рана дијагноза може да бидат присутни во многу мала изобилство. Долната граница на откривање со конвенционалната технологија за имуноанализа е горниот фемтомоларен опсег (10−13 М). Технологијата за дигитална имуноанализа ја подобри чувствителноста на откривање на три логови, до атомоларниот опсег (10−16 М). Оваа способност има потенцијал да отвори нови достигнувања во дијагностиката и терапевтската медицина, но таквите технологии се префрлени на рачни постапки кои не се добро прилагодени за ефикасна рутинска употреба.
Откривање на белковини без антитела Додека откривањето на белковини со антитела е сè уште многу честа појава во молекуларната биологија, развиени се и други методи кои не се потпираат на антитела. Овие методи нудат различни предности, на пример тие често се способни да ја одредат секвенцата на белковината или пептидот, тие може да имаат поголема пропусност од онаа заснована на антитела, и понекогаш можат да ги идентификуваат и квантифицираат белковините за кои не постојат антитела.
Методи за откривање Еден од најраните методи за анализа на белковините е Едмановото разградување (воведена во 1967 година) каде што еден пептид е подложен на повеќе чекори на хемиска разградување за да биде разрешена неговата низа. Овие рани методи се претежно заменети со технологии кои нудат поголема пропусност.