мини| Длабоко мутациско скенирање на мотивот за препознавање на РНК (РРМ2) на белковината за врзување на квасец PolyA (Pab1) Функционална геномика ― поле на молекуларната биологија која се обидува да ги опише функциите и меѓудејствијата на гените (и белковините). Функционалната геномика ги користи огромните податоци создадени од геномски и транскриптомски проекти (како што се проекти за секвенционирање на геном и секвенционирање на РНК). Функционалната геномика се насочува на динамичките гледишта како што се генска транскрипција, превод, регулација на генското изразивање и меѓудејствијата белковина со белковина, наспроти статичните аспекти на геномските информации како што се секвенцата на ДНК или структурите. Клучна одлика на студиите за функционална геномика е нивниот пристап на овие прашања за геномот во широка смисла, кој претежно вклучува методи со висок пропуст, наместо потрадиционален пристап „кандидат-ген“.
Дефиниција и цели на функционалната геномика За да биде разбрана функционалната геномика, важно е прво да биде дефинирана функцијата. Во нивниот труд, Граур и други соработници ја дефинираат функцијата на два можни начини. Тоа се „избран ефект“ и „причинска улога“. Функцијата „избран ефект“ се однесува на функцијата за која е избрана одлика (ДНК, РНК, белковина итн.). Функцијата „причинска улога“ се однесува на функцијата за која е доволна и неопходна одлика. Функционалната геномика обично ја тестира дефиницијата за функцијата „причинска улога“.
Целта на функционалната геномика е да се разбере функцијата на гените или белковините, на крајот на сите компоненти на геномот. Поимот функционална геномика често е користен за да се однесува на многу технички пристапи за проучување на гените и белковините на организмот, вклучувајќи ги „биохемиските, клеточните и/или физиолошките својства на секој генски производ“ додека некои автори ја вклучуваат студијата на негенски елементи во нивната дефиниција. Функционалната геномика може да вклучува и студии за природните генетски варијации со текот на времето (како што е развојот на организмот) или просторот (како што се неговите делови од телото), како и функционални нарушувања како што се мутациите.
Ветувањето за функционална геномика е да создава и синтетизира геномско и протеомско знаење во разбирање на динамичките својства на организмот. Ова потенцијално би можело да обезбеди поцелосна слика за тоа како геномот ја одредува функцијата во споредба со студиите за поединечни гени. Вклучувањето на функционалните геномски податоци често е дел од пристапите на системската биологија.
Техники и примени Функционалната геномика вклучува гледишта поврзани со функцијата на самиот геном, како што се мутација и полиморфизам (како што е анализата на полиморфизмот на еден нуклеотид, како и мерење на молекуларните активности. Последниве опфаќаат голем број „ -омики “ како што се транскриптомика (генско изразување), протеомика (производство на белковини) и метаболомика. Функционалната геномика користи претежно мултиплексни техники за мерење на изобилството на многу или сите генски производи како што се информациска РНК или белковини во биолошки примерок. Пофокусиран пристап на функционална геномика може да ја тестира функцијата на сите варијанти на еден ген и да ги измери ефектите на мутантите со користење на секвенционирање како отчитување на активноста. Заедно, овие мерни модалитети се трудат да ги квантифицираат различните биолошки постапки и да го подобрат нашето разбирање за функциите и меѓудејствијата на гените и белковините.
На ниво на ДНК
Картирање на генетските меѓудејствија Систематско парно бришење на гени или инхибиција на генското изразување може да биде користено за да бидат идентификувани гените со сродна функција, дури и ако тие не општат физички. Епистазата се однесува на фактот дека ефектите за два различни генски соборувања може да не бидат адитивни; односно, фенотипот што произлегува кога два гена се инхибирани може да се разликува од збирот на ефектите од единечните соборувања.
ДНК-ови/белковински меѓудејствија Белковините создадени со превод на информациска РНК (кодирана информација од ДНК за синтеза на белковини) играат главна улога во регулирањето на генското изразување. За да се разбере како тие ја регулираат генското изразување, неопходно е да бидат идентификувани секвенците на ДНК со кои што тие општат. Развиени се техники за да се идентификуваат местата на меѓудејствија на ДНК со белковина. Тие се секвенционирање на чипови, секвенционирање CUT&;RUN и повикувачки картички.
Анализи за пристапност на ДНК Развиени се анализи за да бидат идентификувани регионите на геномот кои се достапни. Овие региони на пристапен хроматин се кандидатски регулаторни региони. Овие анализи се ATAC-seq, DNase-Seq и FAIRE-Seq.
На ниво на РНК
Микрочипови мини| ДНК-микрочип. Микрочиповите го мерат количеството на информациска РНК во примерок што одговара на даден ген или секвенца на ДНК со сонда. Секвенците со сонда се имобилизирани на цврста површина и се оставаат да се хибридираат со флуоресцентно означена „целна“ информациска РНК. Интензитетот на флуоресценцијата на точката е пропорционален на количината на целната секвенца што се хибридизирала со тоа место и затоа на изобилството на таа секвенца на информациска РНК во примерокот. Микрочиповите овозможуваат идентификација на кандидатски гени вклучени во дадена постапка врз основа на варијации помеѓу нивоата на транскрипти за различни услови и заеднички модели на изразување со гени со позната функција.
Сериска анализа на генското изразување Сериската анализа на генското изразување е алтернативен метод на анализа заснован на секвенционирање на РНК наместо хибридизација. Оваа анализа се потпира на секвенционирање на ознаки од 10-17 базни парови кои се единствени за секој ген. Овие ознаки се произведувани од поли-А информациска РНК и се врзувани од крај до крај пред да бидат секвенционирани. SAGE дава непристрасно мерење на бројот на транскрипти по клетка, бидејќи тоа не зависи од претходното знаење за тоа кои транскрипти да бидат проучувани (како што прават микрочиповите).
Секвенционирање на РНК Секвенционирањето на РНК ја презело технологијата на микросреди и сериската анализа на генското изразување во последниве години, како што било забележано во 2016 година, и стана најефикасниот начин за проучување на транскрипцијата и генското изразување. Ова обично се прави со секвенционирање со т.н. „следна генерација“.
Подгрупа на секвенционирани РНК се мали РНК, класа на некодирачки молекули на РНК кои се клучни регулатори на транскрипциското и послетранскрипциското потиштување на гените или потиштувањето на РНК. Секвенционирањето со „следна генерација“ е златна стандардна алатка за откривање, профилирање и анализа на изразување некодирачка РНК.
Масовно напоредни известувачки анализи Масовно напоредните известувачки анализи се технологија за тестирање на цис-регулаторната активност на секвенците на ДНК Овие анализи користат плазмид со синтетички цис-регулаторен елемент горе од промоторот кој управува со синтетички ген како што е зелената флуоресцентна белковина. Библиотеката на цис-регулаторни елементи обично се тестира со користење вакви анализи, библиотеката може да содржи од стотици до илјадници цис-регулаторни елементи. Цис-регулаторната активност на елементите се проценува со користење на активноста на известувачот низводно. Активноста на сите членови на библиотеката е анализирана напоредно со користење на баркодови за секој цис-регулаторен елемент. Едно ограничување на овие аналиси е тоа што активноста е испитувана на плазмид и може да не ги опфати сите гледишта на генската регулација забележани во геномот.
Секвенционирање со самотранскрибирачки активен регулаторен регион Секвенционирањето со самотранскрибирачки активен регулаторен регион е техника слична на Масовно напоредните известувачки анализи за да биде анализирана активноста на засилувачот на случајно скратените геномски фрагменти. Во изворната публикација, случајно исечените фрагменти од геномот на Drosophila биле поставени низводно од минимален промотор. Кандидатите за засилувачи меѓу случајно исечените фрагменти ќе се транскрибираат со помош на минималниот промотор. Со користење на секвенционирање како отчитување и контролирање на влезните количини на секоја секвенца, јачината на наводните засилувачи се оценува со овој метод.
Пертурбациско секвенционирање мини|517x517пкс| Преглед на работниот тек на пертурбациско секвенционирање. Пертурбациското секвенционирање ги спарува посредуваните генски падови со генско изразување на една клетка преку групирано редовните меѓупросторни кратки палиндромски повторувања. Линеарни модели се користени за пресметување на ефектот на падот на еден ген врз изразувањето на повеќе гени.
На белковинско ниво
Квасен двохибриден систем Двохибридниот преглед на квасец ја тестира белковината „мамка“ против многу потенцијални интерактивни белковини („плен“) за да бидат идентификувани физичките меѓудејствија белковина со белковина. Овој систем се заснова на фактор на транскрипција, првично GAL4, чиишто посебни домени за врзување на ДНК и активирање на транскрипција се потребни за белковината да предизвика транскрипција на генот известувач. Во двохибридниот преглед, белковината „мамка“ се спојува со сврзувачкиот домен на GAL4, а библиотека на потенцијални „пленови“ (меѓудејствија) белковини е рекомбинантно изразена во вектор со доменот на активирање. Меѓудејствието, во живо, на белковините мамка и плен во клетка на квасец ги доближува домените на активирање и врзување на GAL4 доволно блиску еден до друг за да резултира со изразување на известувачки ген. Исто така, можно е систематски да биде тестирана библиотека со белковини од мамка против библиотека со белковини од плен за да се идентификуваат сите можни меѓудејствија во клетката.
Масена спектрометрија и афинитетно прочистување/масена спектрометрија Масовната спектрометрија може да ги идентификува белковините и нивните релативни нивоа, па затоа може да биде користена за проучување на белковинското изразување. Кога е користена во комбинација со афинитетното прочистување, масената спектрометрија може да бидат користени за проучување на белковинските комплекси, односно, кои белковини меѓудејствуваат еден со друг во комплексите и во кои соодноси. Со цел да бидат прочистени белковинските комплекси, обично белковината „мамка“ е означен со специфична белковина или пептид што може да биде користен за да биде извлечен комплексот од сложената мешавина. Прочистувањето обично е вршено со користење на антитело или соединение што се врзува за делот за фузија. Белковините потоа се варени во кратки пептидни фрагменти и е користена масена спектрометрија за да бидат идентификувани белковините врз основа на односот маса-полнење на тие фрагменти.
Длабоко мутациско скенирање Во длабокото мутациско скенирање најпрво е синтетизирана секоја можна промена на аминокиселините во дадена белковина. Активноста на секоја од овие варијанти на белковини е анализирана напоредно со користење на баркодови за секоја варијанта. Со споредување на активноста со белковината од дива врста, е идентификуван ефектот на секоја мутација. Иако е можно да биде проценета секоја можна единечна промена на аминокиселина поради комбинаторика, тешко е да бидат тестирани две или повеќе истовремени мутации. Опитите за длабоко мутационо скенирање исто така се користени за да биде заклучена структурата на меѓудејствијата белковина со белковина.
Мутагенеза и фенотипизација Важна функционална одлика на гените е фенотипот предизвикан од мутации. Мутантите може да се произведат со случајни мутации или со насочена мутагенеза, вклучително и насочена мутагенеза, бришење на целосни гени или други техники.
Соборувања (бришење гени)