мини| Во метагеномиката, генетските материјали (ДНК, С) се екстрахирани директно од примероците земени од околината (на пр. почва, морска вода, човечко црево, А) по филтрирањето (B) и се секвенционирани (Е) по множењето со клонирање (D) во пристапот наречен секвенционирање со „сачмарка“ . Овие кратки секвенци потоа може повторно да бидат собрани со помош на методи на склопување (F) за да бидат заклучени поединечните геноми или делови од геномите кои го сочинуваат првобитниот примерок на животната средина. Овие информации потоа може да бидат користеј9 за проучување на разновидноста на видовите и функционалниот потенцијал на микробната заедница во животната средина. Метагеномика ― проучување на генетскиот материјал обновен директно од животната средина или од клинички примероци со метод наречен секвенционирање. Широкото поле може да биле наречено и како геномика на животната средина, економика, геномика на заедницата или микробиомика.
Додека традиционалната микробиологија и секвенционирањето на микробиолошкиот геном и геномиката се потпирани на одгледувани клонирани култури, раното секвенционирање на гените во животната средина клонирало специфични гени (често генот 16S рибозомна РНК) за да произведе профил на разновидност во природен примерок. Таквата работа открила дека огромното мнозинство на микробиолошка биоразновидност е пропуштено со методите засновани на одгледување.
Поради својата способност да ја открие претходно скриената разновидност на микроскопскиот живот, метагеномиката нуди моќен начин за разбирање на микробниот свет што може да го револуционизира разбирањето на биологијата. Како што цената на секвенционирањето на ДНК продолжува да паѓа, метагеномиката сега дозволува микробната екологија да биде истражувана во многу поголем обем и подробности отколку порано. Неодамнешните студии користат насочено секвенционирање или со техниката со „сачмарка“ или со полимеразна верижна реакција за да бидат добиени главно непристрасни примероци од сите гени од сите членови на земените заедници.
Етимологија Поимот „метагеномика“ првпат бил користен од Џо Хендлсман, Роберт М. Гудман, Мишел Р. Рондон, Џон Кларди и Шон Ф. Брејди, а првпат бил појавен во 1998 година. Поимот метагеном упатува на идејата дека збирката на гени секвенционирани од околината може да биде анализирана на начин аналоген на проучувањето на еден геном. Во 2005 година, Кевин Чен и Лиор Пахтер (истражувачи на Универзитетот во Калифорнија, Беркли) ја дефинирале метагеномиката како „примена на современа геномска техника без потреба од изолација и лабораториско одгледување на поединечни видови“.
Историја Конвенционалното секвенционирање започнува со култура на идентични клетки како извор на ДНК. Сепак, раните метагеномски студии откриле дека веројатно постојат големи групи на микроорганизми во многу средини кои не можат да бидат одгледувани и затоа не можат да бидат секвенционирани. Овие рани студии биле насочени на секвенците на 16S рибозомна РНК кои се релативно кратки, често се зачувани во рамките на еден вид и претежно различни помеѓу видовите. Пронајдени се многу секвенци на 16S рибозомни РНК кои не припаѓаат на ниту еден познат култивиран вид, што покажува дека има бројни неизолирани организми. Овие истражувања на гените на рибозомната РНК земени директно од животната средина, откриле дека методите засновани на одгледување наоѓаат помалку од 1% од бактериските и архејните видови во примерокот. Голем дел од интересот за метагеномиката доаѓа од овие откритија кои покажале дека огромното мнозинство на микроорганизми претходно поминале незабележано.
Во 1980-тите години, раната молекуларна работа на терен била спроведена од Норман Р. Пејс и неговите колеги, кои користеле полимеразна верижна реакција за да ја истражат различноста на секвенците на рибозомната РНК. Увидите добиени од овие пробивни студии го навеле Пејс да ја предложи идејата за клонирање на ДНК директно од примероци од животната средина уште во 1985 година. Ова довело до првиот извештај за изолирање и клонирање на голема ДНК од примерок од животната средина, објавен од Пејс и неговите колеги во 1991 година додека Пејс бил на Катедрата за биологија на Универзитетот во Индијана. Значителни напори обезбедиле дека ова не се лажни позитиви на полимеразна верижна реакција и го поддржал постоењето на сложена заедница на неистражени видови. Иако оваа методологија била ограничена на истражување на високо конзервирани, небелковински кодирани гени, таа ги поддржала раните набљудувања засновани на микробна морфологија дека различноста е многу посложена отколку што било познато со методите на одгледување. Набргу потоа во 1995 година, Хели ја пријавил метагеномската изолација на функционалните гени од „зообиблиотеките“ конструирани од сложена култура на организми од животната средина, одгледувани во лабораторија на исушени треви. По напуштањето на лабораторијата на Пејс, Едвард ДеЛонг продолжил на терен и објавил работа што во голема мера ги поставил темелите за филогенијата на животната средина заснована на потписните секвенци на 16S, почнувајќи со изградбата на библиотеки од морски примероци од неговата група.
Во 2002 година, Мија Брајбарт, Форест Ровер и колегите користеле секвенцирање со „сачмарка“ во животната средина (види подолу) за да покажат дека 200 литри морска вода содржи над 5000 различни вируси. Последователните студии покажале дека има повеќе од илјада вирусни видови во човечката столица и веројатно милион различни вируси на килограм морски седимент, вклучувајќи и многу бактериофаги. Во суштина сите вируси во овие студии биле нови видови. Во 2004 година, Џин Тајсон, Џил Банфилд и колегите од Универзитетот во Калифорнија, Беркли и Институтот за заеднички геном секвенционирале ДНК извлечена од систем за одводнување на кисели рудници. Овој напор резултирал со целосен, или речиси целосен, геном за неколку бактерии и археи кои претходно се спротивставиле на обидите за нивно одгледување.
Почнувајќи од 2003 година, Крег Вентер, водач на приватно финансираната паралела на Проектот за човечки геном, ја предводел Глобалната експедиција за земање примероци од океанот, обиколувајќи ја земјината топка и собирајќи метагеномски примероци во текот на патувањето. Сите овие примероци биле секвенционирани со помош на секвенционирање со „сачмарка“, со надеж дека ќе бидат идентификувани нови геноми (а со тоа и нови организми). Пилот-проектот, спроведен во Саргасовото Море, пронајде ДНК од речиси 2000 различни видови, вклучително и 148 видови бактерии досега невидени. Вентер темелно го истражил Западно Крајбрежјег на Соединетите Држави и завршил двегодишна експедиција во 2006 година за истражување на Балтичкото, Средоземното и Црното Море. Анализата на метагеномските податоци собрани за време на ова патување откри две групи организми, едната составена од таксони приспособени на условите на животната средина на „гозба или глад“ и втората составена од релативно помалку, но пообилно и широко распространети таксони првенствено составени од планктони.
Во 2005 година, Стефан К. Шустер од Универзитетот во Пен Стејт и неговите колеги ги објавиле првите секвенци од примерок од животната средина создадени со секвенционирање со голема брзина, во овој случај масовно напоредно пиросеквенционирање развиено од 454 Life Sciences. Друг ран труд во оваа област се појавил во 2006 година од Роберт Едвардс, Форест Рохвер и колегите од Државниот универзитет во Сан Диего.
Секвенционирање мини|328x328пкс| Проточен дијаграм на вообичаен проект за метагеном. Враќањето на секвенци на ДНК подолги од неколку илјади базни парови од примероци од животната средина била многу тешко додека неодамнешниот напредок во молекуларните биолошки техники не дозволил изградба на библиотеки во бактериски вештачки хромозоми, кои обезбедиле подобри вектори за молекуларно клонирање.
Метагеномика со „сачмарка“ Напредокот во биоинформатиката, усовршувањето на засилувањето на ДНК и ширењето на пресметковната моќ во голема мера ја помогнале анализата на секвенците на ДНК обновени од примероците од животната средина, овозможувајќи приспособување на секвенционирањето со „сачмарка“ на метагеномските примероци (познато и како секвенционирање со целосна метагеномска сачмарка). Пристапот, кој е користен за секвенционирање на многу одгледувани микроорганизми и човечкиот геном, случајно ја вади ДНК, секвенционира многу кратки секвенци и ги реконструира во консензусна секвенца. Секвенционирањето со „сачмарка“ открива гени присутни во примероците од животната средина. Историски гледано, библиотеките за клонови биле користени за да биде олеснато ова секвенционирање. Меѓутоа, со напредокот во технологиите за секвенционирање со висока пропусна моќ, чекорот на клонирање повеќе не е неопходен и може да бидат добиени поголеми приноси на податоци за секвенционирање без овој чекор на тесно грло кој бара труд. Метагеномиката со „сачмарка“ дава информации и за тоа кои организми се присутни и кои метаболички постапки се можни во заедницата. Бидејќи собирањето на ДНК од околината во голема мера е неконтролирано, најзастапените организми во примерокот од животната средина се највисоко застапени во добиените податоци за секвенцата. За да се постигне висока покриеност потребна за целосно разрешување на геномите на недоволно застапените членови на заедницата, потребни се големи примероци, честопати премногу. Од друга страна, случајната природа на секвенционирањето со „сачмарка“ гарантира дека многу од овие организми, кои инаку би останале незабележани со користење на традиционалните техники на одгледување, ќе бидат претставени со барем некои мали сегменти од секвенцата.
Секвенционирање со висока пропусност Предност на секвенционирањето со висока пропусна моќ е тоа што оваа техника не бара клонирање на ДНК пред секвенционирање, отстранувајќи една од главните предрасуди и тесни грла во земање примероци од околината. Првите метагеномски студии спроведени со употреба на високопропусна секвенционирање користеле масовно напоредно 454 пиросеквенционирање. Три други технологии кои вообичаено се применувани за земање примероци од околината се Ion Torrent Personal Genome Machine, Illumina MiSeq или HiSeq и Applied Biosystems SOLiD системот. Овие техники за секвенционирање на ДНК создаваат пократки фрагменти од Сенгеровото секвенционирање; Ion Torrent PGM System и 454 пиросеквенционирање обично произведува ~400 bp читања, Illumina MiSeq произведува 400-700 bp читања (во зависност од тоа дали се користат спарени крајни опции), а SOLiD произведува 25-75 bp читања. Историски гледано, овие должини на читање биле значително пократки од вообичаената должина на читање со Сенгеровото секвенционирање од ~750 bp, сепак технологијата Illumina брзо се приближува до овој репер. Сепак, ова ограничување се надоместува со многу поголем број на читања на низата. Во 2009 година, пиросеквенцираните метагеноми создаваат 200-500 мегабази и платформите на Illumina создаваат околу 20-50 гигабази, но овие резултати се зголемиле за редови на големина во последниве години.
Новиот пристап комбинира секвенционирање со „сачмарка“ и снимање на хромозомската конформација, што ја мери близината на било кои две ДНК секвенци во иста клетка, за да го води склопувањето на микробниот геном. Технологиите за долготрајно читање секвенционирање, вклучувајќи ги PacBio RSII и PacBio Sequel од Pacific Biosciences, и Nanopore MinION, GridION, PromethION од Oxford Nanopore Technologies, е уште еден избор за да добиете долги читања на секвенционирање со „сачмарка“ што треба да ја олесни постапката на склопување.
Биоинформатика мини|610x610пкс| Шематски приказ на главните чекори неопходни за анализа на цели метагономски податоци добиени од секвенционирање со „сачмарка“. Софтверот поврзан со секој чекор е прикажан со курзив.