miniatura|upright=2.9|300px|Entrega lentiviral de shRNA e o mecanismo de interferência de ARN em células de mamíferos. Um ARN em forquilha curta, ARN em forquilha pequena, ARN em garfo curto (shRNA/Vector Forquilha, do inglês short hairpin RNA) é uma molécula artificial de ARN com uma volta em forquilha muito apertada que se pode usar para silenciar a expressão génica por meio de interferência de ARN. A expressão do shRNA em células é realizada normalmente pela entrega de plasmídeos ou por meio de vetores virais ou bacterianos. O shRNA é um mediador vantajoso da interferência de ARN porque tem uma velocidade de degradação e de turnover relativamente baixa. No entanto, requer o uso de um vector de expressão, que tem o potencial de causar efeitos secundários nas aplicações medicinais. A escolha de promotor é essencial para se conseguir uma expressão robusta de shRNA. Primeiramente, foram utilizados os promotores da ARN polimerase III, como U6 e H1; no entanto, estes promotores carecem de controlo espacial e temporal. Então, passou-se a usar promotores da ARN polimerase II, que são indutíveis, para regular a expressão do shRNA.
Entrega A expressão do shRNA em células pode ser obtida por meio de entrega por plasmídeos ou por meio de vetores virais ou bacterianos. A entrega de plasmídeos às células por transfeção para obter a expressão de shRNA pode ser realizada usando reagentes disponíveis comercialmente in vitro. No entanto, este método não é aplicável in vivo e tem, portanto, uma utilidade limitada. O uso de um vetor bacteriano para obter a expressão do shRNA nas células é uma estratégia relativamente recente. Baseia-se numa investigação que mostra que a Escherichia coli recombinante, que contém um plasmídeo com shRNA, administrada a ratos pode fazer o knock-down da expressão do gene alvo no epitélio intestinal. Esta estratégia foi utilizada em 2012 em ensaios clínicos para tentar tratar pacientes de polipose adenomatosa familiar. Podem ser utilizados diversos vetores virais para se conseguir a expressão de um shRNA em células, como os vírus adeno-associados, adenovírus, e lentivírus. Com os vírus adeno-associados e os adenovírus, os genomas permanecem episomais. Isto é vantajoso, pois evita-se a mutagénese insercional. É vantajoso porque a progénie da célula perde o vírus rapidamente nas divisões celulares a não ser que a célula se divida muito lentamente. Os vírus adeno-associados diferenciam-se dos adenovírus em que lhes foram eliminados os genes virais e têm uma capacidade de empacotamento diminuída. Os lentivírus integram-se em secções da cromatina ativas transcricionalmente e deste modo passam para as células-filhas. Com esta estratégia aumenta o risco de mutagénese insercional; no entanto, o risco pode ser reduzido usando um lentivírus deficiente em integrase. miniatura|esquerda|A proteína Dicer de Giardia intestinalis.
Mecanismo de ação Uma vez que o vetor se integrou no genoma do hospedeiro, o shRNA é então transcrito no núcleo pela ARN polimerase II ou ARN polimerase III dependendo do promotor escolhido. O produto imita o pri-microARN (pri-miRNA) e é processado por Drosha. O pre-shRNA resultante é exportado do núcleo pela exportina 5. Este produto é depois processado por Dicer e carregado no complexo silenciador induzido por ARN (RISC). A fita com sentido (passageira) é degradada. A fita antissentido (guia) dirige o RISC para o ARNm que tem uma sequência complementar. No caso de uma perfeita complementaridade, o RISC corta o ARNm. No caso de uma complementaridade imperfeita, o RISC reprime a tradução do ARNm. Em ambos os casos, o shRNA origina o silenciamento do gene alvo.
Aplicações em terapia génica Devido à capacidade do shRNA de proporcionar um silenciamento de genes específico e de longa duração, houve muito interesse em usar o shRNA para aplicações terapêuticas. Três exemplos das terapias baseadas em shRNA são explicados abaixo. A Gradalis Inc. desenvolveu a vacina FANG, que é usada no tratamento de cancros avançados. A FANG depende de shRNA bifuncionais (bi-shRNA) contra os fatores de crescimento transformantes imunossupressores TGF β1 e β2. Foram recolhidas células tumorais autólogas dos pacientes e foi introduzido "ex vivo" por eletroporação um plasmídeo que codifica o shRNA bifuncional e o fator estimulante das colónias de granulócitos-macrófagos (GMCSF). Estas células foram depois irradiadas e injetadas de novo no paciente. A Marina Biotech desenvolveu o CEQ508, que é usado para tratar a polipose adenomatosa familiar. O CEQ508 usa um vetor bacteriano para entregar o shRNA contra a β-catenina. A Gradalis Inc. desenvolveu o shRNA bifuncional STMN1 (pbi-shRNA STMN1), que é utilizado para tratar cancros metastáticos ou avançados. Este pbi-shRNA STMN1 é contra a estatmina 1 e é entregue intratumoralmente por meio da tecnologia de vesículas invaginadas bilamelares (BIV) lipoplex (LP). A terapia baseada em shRNA tem que enfrentar vários desafios. O mais significativo é a entrega da molécula. O shRNA é entregue normalmente usando um vetor, e, embora sejam eficientes, representam riscos de segurança significativos. Em particular, a terapia génica baseada em vírus demonstrou ser perigosa em ensaios clínicos passados. Na primeira geração da terapia génica retroviral, alguns pacientes tratados com vetores virais para a síndrome de Wiskott–Aldrich desenvolveram leucemia de células T aguda. Determinou-se que a causa disto foi a localização da inserção do vetor viral. A saturação potencial do RISC é também um problema. Se o shRNA for expresso a níveis que são demasiado altos, a célula poderá ser incapaz de processar corretamente o ARN endógeno, o que causaria problemas significativos. Outro desafio é a possibilidade de o paciente originar uma resposta imunitária contra a terapia. Finalmente, poderá haver efeitos fora do alvo ("off-target") e o shRNA poderá silenciar outros genes que não se pretendia afetar. Para se desenvolver com sucesso novas terapêuticas baseadas no shRNA, todos estes desafios devem ser tidos em conta.
Categoria:RNA Categoria:Interferência de ARN