A reação em cadeia da polimerase digital de droplets (partições/gotículas) (ddPCR) é um melhoramento biotecnológico dos métodos convencionais de reação em cadeia da polimerase (PCR) que pode ser usada para quantificar e amplificar clonalmente cadeias de ácidos nucleicos, incluindo DNA, cDNA ou RNA. A principal diferença entre ddPCR e qPCR reside no método de medição das quantidades de ácidos nucleicos, sendo o primeiro um método mais preciso do que o PCR, embora também mais propenso a erros nas mãos de utilizadores inexperientes. O PCR realiza uma reação por amostra. O ddPCR também realiza uma única reação dentro de uma amostra, porém a amostra é separada em um grande número de partições e a reação é realizada em cada partição individualmente. Essa separação permite uma coleta mais confiável e uma medição mais sensível das quantidades de ácidos nucleicos. O método demonstrou ser útil para o estudo de variações em sequências genéticas, como variantes de número de cópias e mutações pontuais.
O ddPCR é um método no qual uma reação de amostra de (usualmente) 20 microlitros, incluindo primers de ensaio e sondas Taqman ou um corante intercalante, é dividida em aproximadamente 20.000 gotículas de óleo de tamanho nanolítrico por meio de uma técnica de emulsão água-óleo, termociclada até o ponto final em uma placa de PCR de 96 poços, e a amplitude de fluorescência é lida para todas as gotículas em cada poço de amostra em um citômetro de fluxo de gotas. O número de cópias de genes obtido em ensaios de ddPCR tem sido usado para estimar a intensidade da infecção de doenças.
Após a amplificação, a reação é lida usando um leitor de câmera de alta potência com filtro de fluorescência (HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 e Texas Red) para todas as partições. Usando diferentes corantes fluorescentes, é possível medir até quatro genes em simultâneo.
Princípios alt=cartoon with one homogenous micro centrifuge tube labeled "traditional PCR, one fluorescence measurement", and a second containing many individual droplets labeled "digital PCR, thousands of distinct fluorescence measurements"|miniaturadaimagem|Comparação entre PCR quantitativa (qPCR) e PCR digital de droplets (ddPCR) O método de reação em cadeia da polimerase (PCR) é usado para quantificar ácidos nucleicos por meio da amplificação de uma molécula de ácido nucleico com a enzima DNA polimerase . O PCR convencional baseia-se na teoria de que a amplificação é exponencial. Portanto, os ácidos nucleicos podem ser quantificados comparando-se o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produto final do PCR com os de uma amostra de referência. No entanto, muitos fatores complicam esse cálculo, criando incertezas e imprecisões. Esses fatores incluem: os ciclos iniciais de amplificação podem não ser exponenciais; a amplificação por PCR eventualmente atinge um platô após um número incerto de ciclos; e baixas concentrações iniciais de moléculas de ácido nucleico alvo podem não ser amplificadas a níveis detectáveis. Contudo, a limitação mais significativa do PCR é que a eficiência da amplificação por PCR numa amostra de interesse pode ser diferente daquela das amostras de referência. alt=cartoon showing many droplets inside of water-oil emulsion, with number of fluorescent droplets increasing with target molecule concentration|miniaturadaimagem|Gotículas de óleo contendo molécula alvo fluorescente para PCR alt=Graph depicting target molecule concentration predicted by fraction of fluorescent droplets showing exponential rise as fraction increases to 1 and number of target copies per droplet increases from 0 to 3|miniaturadaimagem|A fração de gotículas positivas prevê o número de cópias do alvo por gotícula, modelado pela distribuição de Poisson. 1) Misturar os componentes como se fosse um PCR regular
Em vez de realizar uma reação por poço, o ddPCR envolve a partição da solução de PCR em dezenas de milhares de gotículas de tamanho nanolítrico, onde uma reação de PCR separada ocorre em cada uma delas. Uma solução de PCR é preparada de forma semelhante a um ensaio TaqMan, que consiste em DNA molde (ou RNA), sondas de supressão de fluorescência, primers e uma mistura mestra (master mix) de PCR, que contém DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampões de reação em concentrações ideais.
2) Criar os droplets (partições/gotículas)
Vários métodos diferentes podem ser usados para particionar as amostras, incluindo placas de micropoços, capilares, emulsão de óleo e conjuntos de câmaras miniaturizadas com superfícies de ligação a ácidos nucleicos. A solução de PCR é particionada em unidades menores, cada uma com os componentes necessários para a amplificação.
3) Termociclagem - reação em cadeia como um PCR normal
As unidades particionadas são então submetidas à termociclagem para que cada unidade possa sofrer amplificação por PCR independentemente.
4) Medição da fluorescência
Após múltiplos ciclos de amplificação por PCR, as amostras são verificadas quanto à fluorescência com uma leitura binária de "0" ou "1". A fração de gotículas fluorescentes é registrada. O particionamento da amostra permite determinar o número de moléculas diferentes, assumindo que a população de moléculas segue a distribuição de Poisson, levando em conta a possibilidade de múltiplas moléculas-alvo habitarem uma única gotícula. Usando a lei dos pequenos números de Poisson, a distribuição da molécula-alvo dentro da amostra pode ser aproximada com precisão, permitindo a quantificação da fita-alvo no produto de PCR. Este modelo simplesmente prevê que, à medida que o número de amostras contendo pelo menos uma molécula-alvo aumenta, a probabilidade de as amostras conterem mais de uma molécula-alvo também aumenta. [ <span title="This claim needs references to reliable sources. (November 2022)">citação necessária</span> ]
As vantagens do ddPCR incluem maior precisão por meio do particionamento massivo da amostra, o que garante medições confiáveis na sequência de DNA desejada devido à reprodutibilidade. As taxas de erro são maiores ao detectar pequenas diferenças de expressão com o PCR básico, enquanto as taxas de erro são menores com ddPCR devido às menores diferenças de expressão que podem ser detectadas na sequência de DNA. A própria técnica reduz o uso de um volume maior de reagente necessário, o que inevitavelmente reduzirá o custo da experiência. Além disso, o ddPCR é altamente quantitativo, pois não depende da fluorescência relativa da solução para determinar a quantidade de DNA alvo amplificado.
O ddPCR pode detectar e quantificar mais espécies-alvo individuais por canal de detecção do que o qPCR, em virtude de ser capaz de distinguir alvos com base na sua amplitude de fluorescência diferencial ou pelo uso de combinações de cores distintas para sua detecção. Na mesma reaão, o ddPCR, pode detetar até 4 genes diferentes (Multiplex).
Comparação entre ddPCR e PCR em tempo real (qPCR) O ddPCR mede o número real de moléculas (DNA alvo), pois cada molécula está em uma gota, tornando-se assim uma medição "digital" discreta. Ela fornece quantificação absoluta porque o ddPCR mede a fração positiva das amostras, que é o número de gotas que fluorescem devido à amplificação adequada. Essa fração positiva indica com precisão a quantidade inicial de ácido nucleico molde. De forma semelhante, o PCR em tempo real (qPCR) utiliza fluorescência; no entanto, ele mede a intensidade da fluorescência em momentos específicos (geralmente após cada ciclo de amplificação) para determinar a quantidade relativa da molécula alvo (DNA), mas não pode especificar a quantidade exata sem construir uma curva padrão usando diferentes quantidades de um padrão definido. Ele fornece o limiar por ciclo (CT) e a diferença no CT é usada para calcular a quantidade inicial de ácido nucleico. Assim, o qPCR é uma medição analógica, que pode não ser tão precisa devido à extrapolação necessária para se obter uma medição.
O ddPCR mede a quantidade de DNA após a amplificação estar completa e, em seguida, determina a fração de réplicas. Isso representa uma medição de momento final, pois requer a observação dos dados após a conclusão da experiência. Em contraste, o qPCR registra a fluorescência relativa do DNA em pontos específicos durante o processo de amplificação, o que requer interrupções no processo experimental. Esse aspecto "em tempo real" do qPCR pode, teoricamente, afetar os resultados devido à interrupção da experiência. [ <span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2017)">citação necessária</span> ] Na prática, porém, a maioria dos termocicladores de qPCR lê a fluorescência de cada amostra muito rapidamente no final da etapa de anelamento/extensão, antes de prosseguir para a próxima etapa de fusão, o que significa que essa preocupação hipotética não é realmente relevante ou aplicável para a grande maioria dos investigadores. O ddPCR mede a amplificação medindo os produtos do ciclo de PCR no momento final e, portanto, é menos suscetível a artefatos decorrentes de eficiências de amplificação prejudicadas devido à presença de inibidores de PCR ou incompatibilidade de primers e moldes.
O PCR digital em tempo real (rdPCR) combina as metodologias do PCR digital de droplets (ddPCR) e do PCR quantitativo (qPCR), integrando a precisão do ddPCR com as capacidades de análise em tempo real do qPCR. Esta integração visa proporcionar maior sensibilidade, especificidade e a capacidade de quantificação absoluta de sequências de ácidos nucleicos, contribuindo para a quantificação de material genético em pesquisas científicas e clínicas.
O qPCR é incapaz de distinguir diferenças na expressão génica ou variações no número de cópias que sejam menores que duas vezes. Por outro lado, o ddPCR tem uma precisão maior e demonstrou detectar diferenças de menos de 30% na expressão génica, distinguir entre variações no número de cópias que diferem em apenas 1 cópia e identificar alelos que ocorrem em frequências menores que 0,1%.
Aplicações O PCR digital de droplets tem muitas aplicações em investigação básica, diagnósticos clínicos e testes ambientais. Os seus usos incluem a detecção de patogéneos e análise da saúde digestiva ; biópsia líquida para monitoramento de cancro, monitoramento de rejeição de transplante de órgãos e teste pré-natal não invasivo para a deteção anomalias genéticas graves; análise de variação do número de cópias, análise de expressão de gene único, detecção de sequências raras, perfil de expressão génica e análise de célula única ; a detecção de contaminantes de DNA em bioprocessamento, a validação de edições genéticas e a deteção de alterações específicas de metilação no DNA como biomarcadores de cancro, bem como a determinação do número de cópias de plasmídeos em populações bacterianas. O ddPCR também é frequentemente usado como um método ortogonal para confirmar mutações raras detectadas por sequenciamento de nova geração (NGS) e para validar bibliotecas de NGS. [ citações excessivas ]
Quantificação absoluta O ddPCR permite a quantificação absoluta e reprodutível de ácidos nucleicos alvo com resolução de molécula única. Comparado ao PCR quantitativo analógico (qPCR), a quantificação absoluta com ddPCR não requer uma curva padrão . O ddPCR também apresenta maior tolerância a substâncias inibidoras e ensaios de PCR que amplificam de forma ineficiente em comparação com o qPCR.
Exemplos de aplicações são: Quantificação da presença de sequências específicas de organismos geneticamente modificados contaminantes em alimentos, carga viral no sangue, PBMCs, amostras de soro, tecidos de vilosidades coriônicas, biomarcadores de doenças neurodegenerativas no líquido cefalorraquidiano, e contaminação fecal na água potável.
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