Нокаутування генів (англ. Gene knockouts, або «вимкнення генів») — це основний інструмент генетичної інженерії. Він дозволяє вченим цілеспрямовано вимкнути (або видалити) роботу конкретного гена в генетичному коді організму. Це як вирвати сторінку з інструкцією, щоб подивитися, як це вплине на роботу всієї системи.
Для цього використовують високоточні методи, як-от Гомологічна рекомбінація, CRISPR-Cas9 та .
Навіщо вимикають гени? Основна мета нокаутування генів — зрозуміти, за що відповідає певний ген. Дослідники порівнюють організм, у якого ген вимкнено (нокаут), з нормальним організмом. Якщо після вимкнення гена виникає зміна (наприклад, тварина стає сліпою або стійкою до хвороби), це означає, що вимкнений ген відповідав за цю функцію.
Нокаути широко застосовуються: У вивченні розвитку організму, роботи його органів та систем. У створенні моделей людських хвороб (як-от Рак, Неврологічні розлади) на мишах для тестування нових ліків. Для розуміння механізмів метаболічних порушень.
Типи «вимкнення»
Повний нокаут: Ген вимкнено назавжди і у всіх клітинах організму. Умовний нокаут: Ген можна «вимкнути» лише у певній тканині (наприклад, лише в клітинах печінки) або у потрібний час (наприклад, лише у дорослому віці). Це важливо, коли повне вимкнення гена призвело б до смерті зародка.
Споріднені терміни Нок-ін генів (Gene knock-in): Протилежний процес. Це заміна одного гена на інший, а не його видалення. Множинні нокаути: Якщо вимкнено два гени — це подвійний нокаут (DKO), три гени — потрійний нокаут (TKO), і так далі. Зиготність: Важливо, чи вимкнена одна копія гена (з двох наявних — гетерозиготний нокаут) чи обидві копії (гомозиготний нокаут).
Методологія Нокаутування генів виконується на рівні ДНК, тобто вносяться постійні зміни в генетичний код.
1. Мутації, що відбулися природним шляхом Спочатку ідентифікувалися природні мутації, а потім втрата або інактивація гена підтверджувалася за допомогою секвенування ДНК або інших методів.
Нокаутування генів шляхом мутацій зазвичай проводиться в бактеріях. Ранній приклад використання цієї техніки на Escherichia coli був опублікований у 1989 році.
2. Гасіння генів (Knockdown) Для досліджень нокауту генів також використовується РНК-інтерференція (РНКі), відома як **гасіння генів**. Це як заглушити голос гена. Замість того, щоб видаляти інструкцію (ДНК), вчені використовують спеціальні РНК-молекули (siRNA або ) для руйнування повідомлення (мРНК), яке ген посилає для виробництва білка. В результаті білка виробляється менше, але ген залишається на місці. Це тимчасовий ефект.
3. Гомологічна рекомбінація Традиційно нокаутування досягалося за допомогою гомологічної рекомбінації. Це як заміна розділу книги (гену) на новий розділ, який нічого не значить. У такий спосіб були створені сотні мишачих моделей різних людських захворювань.
Це передбачає створення конструкції ДНК, що містить бажану мутацію, часто маркер стійкості до ліків, який замінює ген. Оскільки цей процес є неефективним (лише $10^{-2}$ до $10^{-3}$ інтеграцій ДНК), для відбору клітин з нокаутом використовують маркер стійкості до ліків.
4. Сайт-специфічні нуклеази (сучасні методи) Це найефективніші та найточніші методи, що використовують «молекулярні ножиці» для розрізання ДНК. Ремонт розриву клітинними механізмами часто відбувається з помилками (вставки чи видалення), що викликає і вимикає ген.
(ZFNs): Використовують ДНК-зв'язуючі домени та ендонуклеазу для розрізання ДНК. (TALENs): Містять ДНК-зв'язуючий домен, який розпізнає по одній парі основ, та нуклеазу. CRISPR-Cas9: Найпопулярніший інструмент. Спеціальна РНК наводить фермент Cas9 (ножиці) точно на цільовий ген. Cas9 розрізає ДНК, що призводить до інактивації гена.
5. Умовні нокаути (Conditional Knockouts) Умовний нокаут дозволяє видаляти ген у спосіб, специфічний для певної тканини. Це досягається шляхом введення коротких послідовностей loxP навколо гена, які пізніше розпізнаються ферментом Cre-рекомбіназа.
Використання Нокаути в першу чергу використовуються для: Розуміння функції специфічного гена або ділянки ДНК шляхом порівняння нокаутованого організму з диким типом. Як інструмент для скринінгу ліків у розробці, наприклад, у Saccharomyces cerevisiae з використанням бібліотек нокаутних організмів.
Див. також Редагування геному
Примітки
Посилання Diagram of targeted gene replacement Frontiers in Bioscience Gene Knockout Database (available on archive only) International Knockout Mouse Consortium KOMP Repository