O termo química bioortogonal refírese a calquera reacción química que pode ocorrer dentro dos sistemas vivos sen interferir cos procesos bioquímicos nativos. O termo bioorthogonal chemistry foi acuñado por Carolyn R. Bertozzi en 2003. Desde a súa introdución, o concepto de reacción bioortogonal permitiu o estudo de biomoléculas como glicanos, proteínas, e lípidos en tempo real en sistemas vivos sen toxicidade celular. Desenvolvéronse varias estratexias de ligadura química que cumpren os requisitos da bioortogonalidade, incluíndo a cicloadición 1,3-dipolar entre azidas e ciclooctilos (tamén denominada química de clic libre de cobre), entre nitronas e ciclooctilos, oxima/hidrazone formación de hidrazona a partir de aldehídos e cetonas, a ligadura de tetrazina, a reacción de clic baseada en isocianuros, e, máis recentemente, a ligadura de cuadriciclanos.
O uso da química bioortogonal adoita realizarse en dous pasos. En primeiro lugar, modifícase un substrato celular cun grupo funcional bioortogonal (reporteiro químico) e introdúcese na célula; os substratos inclúen metabolitos, inhibidores enzimáticos, etc. O informador químico non debe alterar a estrutura do substrato drasticamente para evitar afectar á súa bioactividade. En segundo lugar, introdúcese unha sonda que contén o grupo funcional complementario para reaccionar e marcar o substrato.
Aínda que se desenvolveron reaccións bioortogonais eficaces como a química de clic sen cobre, o desenvolvemento de novas reaccións segue xerando métodos ortogonais para o etiquetado que permiten utilizar múltiples métodos de etiquetado nos mesmos biosistemas. Bertozzi foi galardoada co Premio Nobel de Química en 2022 polo seu desenvolvemento da química do clic (click chemistry) e da química bioortogonal. ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Bioorthogonal_cell_labeling.svg/220px-Bioorthogonal_cell_labeling.svg.png|miniatura| Aquí móstrase unha ligadura bioortogonal entre a biomolécula X e o compañeiro reactivo Y. Para ser considerados bioortogonais, estes socios reactivos non poden perturbar outras funcións químicas que se atopan naturalmente dentro da célula.
Etimoloxía A palabra bioortogonal provén do grego bio [vivo] e orthogōnios [en ángulo recto]. Así, literalmente, unha reacción que vai perpendicular a un sistema vivo, polo que non o perturba.
Requisitos de bioortogonalidade Para ser considerada bioortogonal, unha reacción debe cumprir unha serie de requisitos:
Selectividade: a reacción debe ser selectiva entre grupos funcionais endóxenos para evitar reaccións secundarias con compostos biolóxicos. Inercia biolóxica: os socios reactivos e o enlace resultante non deben posuír ningún modo de reactividade capaz de perturbar a funcionalidade química nativa do organismo obxecto de estudo. Inercia química: o enlace covalente debe ser forte e inerte para as reaccións biolóxicas. Cinética:A reacción debe ser rápida, na escala de tempo dos procesos celulares (minutos) para evitar a competencia en reaccións que poidan diminuír os pequenos sinais de especies menos abundantes. As reaccións rápidas tamén ofrecen unha resposta rápida, necesaria para rastrexar con precisión os procesos dinámicos. Biocompatibilidade das reaccións: as reaccións deben ser non tóxicas e deben funcionar en condicións biolóxicas tendo en conta o pH, os ambientes acuosos e a temperatura. A farmacocinética é unha preocupación crecente a medida que a química bioortogonal se expande a modelos animais vivos. Enxeñaría accesible: o informador químico debe ser capaz de incorporarse a biomoléculas mediante algunha forma de enxeñaría metabólica ou proteica. De xeito óptimo, un dos grupos funcionais tamén é moi pequeno para que non perturbe o comportamento nativo.
Enlace de Staudinger
Bioortogonalidade A azida pode actuar como un electrófilo brando que prefire os nucleófilos brandos como os fosfanos. Isto contrasta coa maioría dos nucleófilos biolóxicos que normalmente son nucleófilos duros. A reacción prodúcese selectivamente en condicións de tolerancia á auga para producir un produto estable.
As fosfinas están completamente ausentes dos sistemas vivos e non reducen os enlaces disulfuro a pesar do potencial de redución leve. As azidas demostraron ser biocompatibles en fármacos aprobados pola FDA como a azidotimidina e a través doutros usos como enlaces cruzados. Ademais, o seu pequeno tamaño permítelles incorporarse facilmente ás biomoléculas a través das vías metabólicas celulares.
Mecanismo
Reacción clásica de Staudinger alt=The mechanism of the Staudinger reaction|600x600px|O mecanismo da reacción de Staudinger
A fosfina nucleófila ataca a azida no nitróxeno terminal electrófilo. A través dun estado de transición de catro membros, o N 2 pérdese para formar un aza-iluro. O iluro inestable hidrolízase para formar óxido de fosfina e unha amina primaria. Non obstante, esta reacción non é inmediatamente bioortogonal porque a hidrólise rompe o enlace covalente no aza-iluro.
Ligadura Staudinger alt=The mechanism of the Staudinger ligation using a modified triarylphosphine|600x600px|O mecanismo da ligadura de Staudinger mediante unha triarilfosfina modificada
A reacción foi modificada para incluír un grupo éster orto ao átomo de fósforo nun dos aneis arilo para dirixir o aza-iluro a través dunha nova vía de reactividade co fin de superar a hidrólise inmediata colocando o éster para aumentar a concentración local. O ataque nucleófilo inicial á azida é o paso limitante da velocidade. O iluro reacciona coa trampa de éster electrófilo mediante ciclación intramolecular para formar un anel de cinco membros. Este anel sofre hidrólise para formar un enlace amida estable.
Limitacións Os reactivos de fosfina sofren lentamente a oxidación do aire nos sistemas vivos. Ademais, é probable que sexan metabolizados in vitro por encimas do citocromo P450.
A cinética das reaccións é lenta con constantes de velocidade de segunda orde arredor de 0,0020 M −1 •s −1 . Os intentos de aumentar as taxas de ataque nucleófilo engadindo grupos doadores de electróns ás fosfinas melloraron a cinética, pero tamén aumentaron a taxa de oxidación do aire.
A cinética deficiente require que se usen altas concentracións de fosfina, o que leva a problemas co sinal de fondo elevado nas aplicacións de imaxe. Intentáronse para combater o problema do fondo elevado mediante o desenvolvemento de reactivos de fosfina fluoroxénica baseados en fluoresceína e luciferina, pero a cinética intrínseca segue sendo unha limitación.
Química de clic sen cobre A química de clic sen cobre é unha reacción bioortogonal desenvolvida por primeira vez por Carolyn Bertozzi como unha variante activada dunha cicloadición de Huisgen azida alquino, baseada no traballo de Karl Barry Sharpless et al. A diferenza de CuAAC, a química de clic libre de Cu foi modificada para ser bioortogonal eliminando un catalizador de cobre citotóxico, permitindo que a reacción se produza rapidamente e sen toxicidade celular viva. En lugar de cobre, a reacción é unha cicloadición de alquinazida promovida por cepas (SPAAC). Desenvolveuse como unha alternativa máis rápida á ligadura Staudinger, coas primeiras xeracións reaccionando máis de sesenta veces máis rápido. A incrible bioortogonalidade da reacción permitiu que a reacción de clic sen cobre se aplique dentro de células cultivadas, peixe cebra vivo e ratos. ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Clickscheme.png/600px-Clickscheme.png|alt=click chemistry labeling|centro|600x600px| prema en etiquetaxe química
Toxicidade do cobre A clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre foi unha reacción de clic extremadamente rápida e eficaz para a bioconxugación, pero non é adecuada para o seu uso en células vivas debido á toxicidade dos ións Cu(I). A toxicidade débese ao dano oxidativo das especies reactivas do osíxeno formadas polos catalizadores de cobre. Tamén se atopou que os complexos de cobre inducen cambios no metabolismo celular e son absorbidos polas células.
Houbo algún desenvolvemento de ligandos para previr o dano das biomoléculas e facilitar a eliminación en aplicacións in vitro . Non obstante, descubriuse que os diferentes ambientes de ligandos dos complexos aínda poden afectar o metabolismo e a captación, introducindo unha perturbación non desexada na función celular.
Bioortogonalidade O grupo azida é particularmente bioortogonal porque é extremadamente pequeno (favorable para a permeabilidade celular e evita perturbacións), metabolicamente estable e non existe naturalmente nas células e, polo tanto, non ten reaccións secundarias biolóxicas competidoras. Aínda que as azidas non son o 1,3-dipolo máis reactivo dispoñible para a reacción, son preferidas pola súa relativa falta de reaccións secundarias e pola súa estabilidade en condicións sintéticas típicas. O alquino non é tan pequeno, pero aínda ten a estabilidade e a ortogonalidade necesarias para o marcado in vivo. Os ciclooctinos son tradicionalmente o cicloalquino máis común para os estudos de etiquetaxe, xa que son o anel de alquino estable máis pequeno.
alt=The mechanism proceeds through a standard 1,3-dipolar cycloaddition.|350x350px|O mecanismo procede a través dunha cicloadición estándar 1,3-dipolar.
A reacción procede como unha cicloadición 1,3-dipolar estándar, un tipo de desprazamento pericíclico concertado asíncrono. A natureza ambivalente do 1,3-dipolo debería facer imposible a identificación dun centro electrófilo ou nucleófilo na azida de tal xeito que a dirección do fluxo de electróns cíclico careza de sentido. [p] Porén, os cálculos demostraron que a distribución de electróns entre os nitróxenos fai que o átomo de nitróxeno máis interno teña a maior carga negativa.
Rexioselectividade Aínda que a reacción produce unha mestura rexioisomérica de triazoles, a falta de rexioselectividade na reacción non é unha gran preocupación para a maioría das aplicacións actuais. Os requisitos máis rexioespecíficos e menos bioortogonais son mellor atendidos pola cicloadición Huisgen catalizada por cobre, especialmente tendo en conta a dificultade sintética (en comparación coa adición dun alquino terminal) de sintetizar un ciclooctilo con tensión.
Desenvolvemento de ciclooctilos Ciclooctino Constante de velocidade de segunda orde (M −1 s −1 ) OUT 0,0024 ALO 0,0013 MOFO 0,0043 DIFO 0,076 DIBO 0,057 BARAC 0,96 DIBAC (ADIBO) 0,31 DIMAC 0,0030 ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/95/Cyclooctynes.png/450px-Cyclooctynes.png|alt=Strained cyclooctynes developed for copper-free click chemistry|esquerda|450x450px| Ciclooctinos colados desenvolvidos para a química de clics sen cobre OCT foi o primeiro ciclooctilo desenvolvido para a química de clics sen Cu. Aínda que os alquinos lineais non son reactivos a temperaturas fisiolóxicas, a OCT foi capaz de reaccionar facilmente coas azidas en condicións biolóxicas sen mostrar toxicidade. Non obstante, era pouco soluble en auga e a cinética apenas mellorou sobre a ligadura de Staudinger. O ALO (aryl-less octyne) foi desenvolvido para mellorar a solubilidade na auga, pero aínda tiña unha cinética pobre.