A Enciclopedia de Elementos do ADN ou ENCODE (polas súas siglas en inglés de Encyclopedia of DNA Elements) é un proxecto de investigación pública que ten o obxectivo de "construír unha lista completa dos elementos funcionais do xenoma humano."
ENCODE tamén apoia investigacións adicionais biomédicas ao "xerar recursos comunitarios de datos xenómicos, software, ferramentas e métodos para a análise xenómica e produtos que son resultado de análises e interpretacións de datos."
A fase de ENCODE desenvolvida no período 2016-2019 consistía en adicionar profundidade aos seus recursos aumentando o número de tipos celulares, tipos de datos e ensaios e agora inclúe apoio para o exame do xenoma do rato.
Historia ENCODE lanzouno o Instituto Nacional de Investigación do Xenoma Humano dos Estados Unidos (National Human Genome Research Institute, NHGRI) en setembro de 2003. Pretendía ser unha continuación do Proxecto Xenoma Humano e tiña como obxectivo identificar todos os elementos funcionais no xenoma humano.
No proxecto está implicado un consorcio mundial de grupos de investigación e pode accederse aos datos xerados deste proxecto a través de bases de datos públicas. A publicación inicial de ENCODE foi en 2013 e desde entón foi cambiando de acordo coas recomendacións dos membros do consorcio e a ampla comunidade de científicos que usan o Portal para acceder aos datos de ENCODE. Os dous obxectivos de ENCODE son servir como unha base de datos accesible publicamente para "protocolos experimentais, procedementos analíticos e os propios datos," e "a mesma interface debería servir metadatos coidadosamente verificados que rexistren a procedencia dos datos e xustifiquen a súa interpretación en termos biolóxicos." O proxecto empezou a súa cuarta fase (ENCODE 4) en febreiro de 2017.
Motivación e importancia
Estímase que os humanos teñen aproximadamente uns 20.000 xenes codificantes de proteínas, que abranguen só un 1,5% do ADN do xenoma humano. O obxectivo principal do proxecto ENCODE é determinar o papel do compoñente restante do xenoma, gran parte do cal era considerado tradicionalmente como "lixo". A actividade e expresión dos xenes codificantes de proteínas poden ser modulados polo reguloma (unha variedade de elementos de ADN, como os promotores, secuencias reguladoras transcricionais e rexións da estrutura da cromatina e modificación de histonas). Pénsase que os cambios na regulación da actividade dos xenes poden alterar a produción de proteínas e procesos celulares e orixinan doenzas. Determinar a localización destes elementos reguladores e como inflúen na transcrición de xenes podería revelar as ligazóns que hai entre as variacións na expresión de certos xenes e o desenvolvemento de enfermidades.
ENCODE tamén pretende ser un recurso completo que permita á comunidade científica comprender mellor como o xenoma pode afectar á saúde humana e para "estimular o desenvolvemento de novas terapias para previr e tratar estas enfermidades". miniatura|a. Gráfico de tedencia de publicacións da comunidade e do consorcio ENCODE desde 2007 a 2019. b. Tipos de publicacións que usan datos de ENCODE segundo o campo de investigación.
O Consorcio ENCODE
O Consorcio ENCODE está composto principalmente de científicos que están financiados polo Instituto Nacional de Investigación do Xenoma Humano dos Estados Unidos (NHGRI). Outros participantes que contribúen ao proxecto incorporáronse ao Consorcio ou Grupo de Traballo de Análise.
A fase piloto constaba de oito grupos de investigación e doce grupos que participaban na Fase de Desenvolvemento de Tecnoloxía de ENCODE. Despois de 2007 o número de participantes ampliouse ata chegar a 440 científicos baseados en 32 laboratorios por todo o mundo e cando a fase piloto estaba oficialmente rematada. Nese momento o consorcio constaba de diferentes centros que realizaban diferentes tarefas.
ENCODE é membro do Consorcio do Epixenoma Humano Internacional (IHEC).
O principal requirimento do NHGRI para os produtos de investigación financiados por ENCODE é compartilos de xeito libre e moi accesible para todos os investigadores para promover a investigación xenómica. A investigación de ENCODE permite a reproducibilidade e así a transparencia do software, métodos, datos e outras ferramentas relacionadas coa análise xenómica.
O Proxecto ENCODE
ENCODE está actualmente aplicado en catro fases: a fase piloto e a fase de desenvolvemento de tecnoloxía, que foron iniciadas simultaneamente, e a fase de produción. A cuarta fase é unha continuación da terceira e inclúe a caracterización funcional e unha maior análise integrativa para a enciclopedia.
O obxectivo da fase piloto era identificar un conxunto de procedementos que, en combinación, poderían aplicarse rendiblemente e a alto rendemento para caracterizar completamente e con exactitude grandes rexións do xenoma humano. A fase piloto ten que revelar as carencias do conxunto de ferramentas actuais para detectar secuencias funcionais, e estaba pensada tamén para revelar se algúns métodos usados ata ese momento eran ineficientes ou inadecuados para a utilización a grande escala. Algúns destes problemas tiñan que ser abordados na fase de desenvolvemento de tecnoloxía de ENCODE, que pretendía idear novos laboratorios e métodos computacionais que mellorarían a nosa capacidade de identificar secuencias funcionais coñecidas ou descubrir novos elementos xenómicos funcionais. Os resultados das dúas primeiras fases determinaron cal era o mellor camiño a percorrer para analizar o restante 99% do xenoma humano nunha fase de produción completa e rendible.
O Proxecto en fase I de ENCODE: o proxecto piloto A fase piloto testou e comparou os métodos existentes para analizar rigorosamente unha porción definida da secuencia do xenoma humano. Foi organizado como un consorcio aberto e xuntou investigadores con diversos campos e experiencia para avaliar os méritos relativos de todo un conxunto de técnicas, tecnoloxías e estratexias. A fase de desenvolvemento de tecnoloxía concorrente do proxecto ten o obxectivo de desenvolver novos métodos de alto rendemento para identificar elementos funcionais. O obxectivo destes esforzos era identificar un conxunto de enfoques que permitisen a identificación completa de todos os elementos funcionais no xenoma humano. Por medio do proxecto piloto de ENCODE, o Instituto Nacional de Investigación do Xenoma Humano (NHGRI) avaliou as capacidades de diferentes enfoques para ser escalados para analizar o xenoma humano completo e atopar as carencias na capacidade de identificar elementos funcionais na secuencia xenómica.
O proceso do proxecto piloto de ENCODE implica interaccións estreitas entre os científicos experimentais e computacionais para avaliar diversos métodos de anotar o xenoma humano. Seleccionouse un conxunto de rexións que representan aproximadamente o 1% (30 Mb) do xenoma humano como diana para o proxecto piloto e foi analizado por todos os investigadores do proxecto piloto de ENCODE. Todos os datos xerados polos participantes de ENCODE sobre estas rexións foron liberados rapidamente nas bases de datos públicas.
Selección de dianas
Para o seu uso no proxecto piloto de ENCODE, seleccionáronse rexións definidas do xenoma humano (correspondente a 30Mb, aproximadamente o 1% do xenoma humano total). Estas rexións servían como os alicerces sobre os que comprobar e avaliar a efectividade dun diverso conxunto de métodos e tecnoloxías para atopar varios elementos funcionais no ADN humano.
Antes de embarcarse na selección de dianas, decidiuse que o 50% das 30Mb da secuencia sería seleccionada manualmente mentres que a secuencia restante sería seleccionada aleatoriamente. Os dous criterios principais para as rexións seleccionadas manualmente eran: 1) a presenza de xenes ben estudados ou outros elementos de secuencia coñecidos, e 2) a existencia dunha cantidade substancial de datos de secuencia comparativos. Seleccionouse manualmente un total de 14,82Mb da secuencia usando esta estratexia, que constaba de 14 dianas que en tamaño ían de 500kb a 2Mb.
O restante 50% das 30Mb da secuencia estaba composto de trinta rexións de 500kb seleccionadas segundo unha estratexia de mostras aleatorias estratificadas baseada na densidade de xenes e o nivel de conservación non exónica. A decisión de usar estes criterios en particular fíxose para asegurar unha boa mostra de rexións xenómicas que varían amplamente no seu contido de xenes e outros elementos funcionais. O xenoma humano foi dividido en tres partes: o 20% superior, o 30% intermedio e o 50% inferior, ao longo de dous eixes: 1) densidade de xenes e 2) nivel de conservación non exónica con respecto á secuencia xenómica do rato ortóloga (véxase máis abaixo), nun total de nove estratos. En cada estrato elixíronse tres rexións aleatorias para o proxecto piloto. Para os estratos subrepresentados polas escollas manuais, elixiuse unha cuarta rexión, polo que en total foron 30 rexións. Para todos os estratos deseñouse unha rexión de "backup" para usala no caso de xurdiren problemas técnicos non previstos.
En maior detalle, os criterios de estratificación foron os seguintes: Densidade de xenes: o valor de densidade de xenes dunha rexión era a porcentaxe de bases cubertas polos xenes da base de datos Ensembl ou polos mellores aliñamentos de BLAT (ferramenta de aliñamento similar a BLAST) de ARNm humano na base de datos do UCSC Genome Browser. Conservación non exónica: a rexión foi dividida en subfiestras non solapantes de 125 bases. As subfiestras que mostraron menos do 75% de aliñamento de bases coa secuencia do rato foron descartadas. Para as restantes subfiestras utilizouse como valor de conservación non exónica a porcentaxe con polo menos o 80% de identidade de bases co rato e que non correspondían con xenes de Ensembl, aliñamentos BLASTZ de ARNm de GenBank, predicións de xenes de Fgenesh++, predicións de xenes de TwinScan, aliñamentos EST empalmados, ou secuencias repetidas (ADN).
Os valores anteriores foron computados dentro de fiestras de 500 kb non solapantes de secuencia finalizada ao longo do xenoma, e usados para asignar cada fiestra a un estrato.
Resultados da fase piloto
A fase piloto acabou con éxito e os resultados publicáronse en xuño de 2007 na revista Nature e nun número especial de Genome Research; os resultados publicados no primeiro artigo mencionado adiantaron o coñecemento colectivo sobre a función do xenoma humano en varias áreas principais, incluídas as seguintes máis salientables: O xenoma humano é transcrito de forma xeneralizada, de tal xeito que a maioría dos seus pares de bases están asociados con polo menos un transcrito primario e moitos transcritos líganse con rexións distais a loci codificantes de proteínas establecidos. Moitos transcritos non codificantes de proteínas novos foron identificados, con moitos destes loci codificantes de proteínas solapantes e outros localizados en rexións do xenoma que previamente se pensaba que eran transcricionalmente silenciosas. Identificáronse numerosos sitios de inicio da transcrición previamente non recoñecidos, moitos dos cales mostran a estrutura da cromatina e propiedades de unión a proteínas específicas de secuencia similares a promotores ben coñecidos. As secuencias reguladoras que rodean os sitios de iniciación da transcrición están distribuídas simetricamente, sen ningún nesgo cara a rexións augas arriba. A accesibilidade á cromatina e os padróns de modificación de histonas son altamente preditivos tanto da presenza coma da actividade dos sitios de inicio da transcrición. Os sitios hipersensibles á DNaseI distais teñen padróns de modificacións de histonas características que os distinguen fiablemente dos promotores; algúns destes sitios distais mostran marcas consistentes coa función do illador (insulator). O momento da replicación do ADN está correlacionado coa estrutura da cromatina.