A Inmunoprecipitación (IP) é unha técnica para precipitar un antíxeno proteico dunha solución usando un anticorpo que se une especificamente a esa determinada proteína. Este proceso pode usarse para illar e concentrar unha determinada proteína nunha mostra que contén milleiros de proteínas diferentes. A inmunoprecipitación require que o anticorpo estea acoplado a un substrato sólido nalgún momento do procedemento.DeCaprio J, Kohl TO. Immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 Nov 2;2020(11). doi: 10.1101/pdb.top098509. .Opentrons Immunoprecipitation technique
Tipos Inmunoprecipitación dunha proteína individual (IP) Supón usar un anticorpo que é específico para unha proteína coñecida para illar esa proteína dunha disolución que contén moitas proteínas diferentes. Estas solucións adoitan estar en forma de lisado cru dun tecido vexetal ou animal. Outros tipos de mostras poden ser fluídos corporais ou outras mostras de orixe biolóxica.G-Biosciences Immunoprecipitation
Inmunoprecipitación de complexos proteicos (Co-IP) A inmunoprecipitación de complexos proteicos intactos (é dicir, antíxenos xunto coas proteínas ou ligandos unidos a elas) coñécese como coinmunoprecipitación (Co-IP). A Co-IP funciona seleccionando un anticopo que ten como diana unha proteína coñecida que se cre é un membro menor dun complexo proteico máis grande. Ao unirse o anticorpo a este membro coñecido é posible arrastrar todo o complexo proteico fóra da solución e así poder identificar os membros descoñecidos do complexo.
Isto funciona cando as proteínas que forman parte do complexo están unidas entre si fortemente, o que fai posible arrastrar moitos membros do complexo fóra da solución acoplando un anticorpo a un só membro. Este concepto de arrastre de complexos en solución denomínase na literatura inglesa "pull-down". A Co-IP é unha técnica potente que se usa habitualmente en bioloxía molecular para analizar as interaccións proteína-proteína.
Un determinado anticorpo adoita seleccionar unha subpoboación da súa proteína diana que ten o epítopo exposto, o que fai que non poida identificar as proteínas dos complexos que teñen o epítopo oculto. Por isto raramente é posible precipitar nin a metade dunha forma proteica dada dunha mostra cun só anticorpo, mesmo usando un grande exceso de anticorpo. A medida que se realizan sucesivas roldas de unión e anticorpos e de inmnoprecipitación, o número de proteínas identificadas pode seguir crecendo. As proteínas identificadas pode que nin sequera existan formando un só complexo nun momento dado, senón que poden constituír unha rede de proteínas que interaccionan entre si en diferentes momentos e con diferentes propósitos. Repetir o experimento tomando como dianas diferentes membros do complexo proteico permite facer unha dobre comprobación dos resultados. Cada rolda de precipitacións debería resultar na recuperación tanto da proteína coñecida orixinal coma doutros membros do complexo previamente identificados (e incluso novos membros). Repetindo a inmunoprecipitación deste xeito, pódese verificar que cada membro identificado do complexo proteico era unha identificación válida. Pero se unha determinada proteína só pode recuperarse tomando como diana un dos membros coñecidos mais non outro membro coñecido, entón pode poñerse en dúbida que esa proteína sexa membro do complexo.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) miniatura|Proceso de traballo na secuenciación ChIP. A inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) é un método para determinar a localización de sitios de unión no ADN no xenoma para unha determinada proteína de interese. Esta técnica dános unha imaxe das interaccións proteína-ADN que se producen dentro do núcleo de células ou tecidos vivos. Trátase dun método in vivo a diferenza doutras estratexias tradicionalmente usadas para responder ás mesmas cuestións.
O principio no que se basea este ensaio é que a proteínas que se unen ao ADN (incluíndo factores de transcrición e histonas) nas células vivas poden ser ligadas co ADN ao que se unen. Usando un anticorpo que é específico para unha suposta proteína que se une ao ADN, pódese inmunoprecipitar o complexo proteína-ADN nun lisado celular. A ligazón entre ambos adoita realizarse aplicando formaldehido ás células ou tecidos, aínda que ás veces é vantaxoso usar un ligador máis definido e consistente como o dimetil 3,3′-ditiobispropionimidato-2 HCl (DTBP).Rashid, K. A., Hevi, S., Chen, Y., Le Cahérec, F., & Chuck, S. L. (2002). A Proteomic Approach Identifies Proteins in Hepatocytes That Bind Nascent Apolipoprotein B. The Journal of Biological Chemistry, 277(24), 22010–22017. https://doi.org/10.1074/jbc.M112448200 Despois de que se ligan, as células lísanse e o ADN rómpese en fragmentos de 0,2–1,0 kb de lonxitude por sonicación. Nese momento, realízase a inmunoprecipitación resultando na purificación dos complexos proteína-ADN. Despois quéntanse os complexos proteína-ADN para inverter a ligazón creada polo formaldehido dos complexos proteína-ADN, o que permite separar o ADN das proteínas. A identidade e cantidade dos fragmentos de ADN illados pode despois determinarse pola reacción en cadea da polimerase (PCR). A limitación ao realizarmos unha PCR nos fragmentos illados é que se debe ter unha idea de que rexión xenómica é a diana para podermos xerar os cebadores de PCR correctos. Por veces, esta limitación pode evitarse sipmlemente clonando o ADN xenómico illado nun vector plásmido e despois usando cebadores que son específicos para a rexión clonada dese vector. Alternativamente, cando se quere atopar o lugar onde se une unha proteína a escala de todo o xenoma, úsase a secuenciación ChIP e recentemente xurdiu unha tecnoloxía estándar que pode localizar os sitios de unión de proteínas dun modo barato e de alto rendemento, permitindo tamén a caracterización do cistroma. Previamente, usábase a micromatriz de ADN (ChIP-on-chip ou ChIP-chip).
Inmunoprecipitación de ribonucleoproteínas (RIP e CLIP) A RIP e a CLIP poden ambas purificar unha proteína específica que se une ao ARN para identificar os ARNs unidos, e así estudar as ribonucleoproteínas (RNPs). Na RIP, extráense os ARNs copurificados e compárase o seu enriquecemento cun control, o que orixinalmente se facía cunha micromatriz ou RT-PCR. Na inmunoprecipitación de ligazón (CLIP, do inglés cross-linking immunoprecipitation), as moléculas das células son ligadas (crosslinked) con UV antes da lise, e despois fanse uns pasos de purificación adicionais ademais da inmunoprecipitación estándar, incluíndo a fragmentación de ARN parcial, lavado con alta concentración de sales, separación por SDS-PAGE e transferencia de membrana, e identificación de sitios de unión ao ARN directos por secuenciación de ADNc.
Proteínas etiquetadas miniatura|Ensaio de inmunoprecipitación usando proteínas etiquetadas.|300x300px Un dos principais obstáculos técnicos da inmunoprecipitación é a gran dificultade de xerar un anticorpo que teña como diana específica unha soa proteína concreta coñecida. Para evitar este obstáculo moitos grupos preparan por enxeñaría etiquetas sobre os extremos C- ou N-terminais da proteína de interese. A vantaxe é que pode usarse a mesma etiqueta repetidas veces en moitas proteínas diferentes e pode usarse o mesmo anticorpo cada vez. As vantaxes de usar proteínas etiquetadas son tan grandes que esta técnica fíxose común para todos os tipos de inmunoprecipitación, incluíndo todos os tipos de IP detallados antes. Exemplos de etiquetas en uso son a da proteína fluorescente verde (GFP), a da glutatión-S-transferase (GST) e a etiqueta FLAG. Aínda que o uso de etiqueta para as inmunoprecipitacións é conveniente, pode ter tamén problemas porque a propia etiqueta pode escurecer as interaccións nativas ou introducir interaccións novas e non naturais.
Métodos Os dous métodos xerais para a inmunoprecipitación son o método de captura directa e o de captura indirecta.Antibodies.com Immunoprecipitation guide
Directo Os anticorpos que son específicos para unha proteína deerminada (ou grupo de proteínas) son inmobilizados sobre un substrato en fase sólida como as microdoas (microboliñas) superparamegnéticas ou en doas de agarosa microscópicas (non magnéticas). As boliñas con anticorpos unidos son despois engadidas á mestura proteica, e as proteínas que son etiquetadas polos antiorpos son capturadas nas boliñas polos anticorpos, é dicir, inmunoprecipitan.
Indirecto
Os anticorpos que son espeíficos dunha determinada proteína ou grupo de proteínas engádense directamente á mestura de proteínas. Os anticorpos non se adheriron aínda ao soporte en fase sólida, senón que flotan libremente na mestura de proteínas e poden unirse ás súas dianas. A medida que pasa o tempo, engádense as boliñas ou doas cubertas de proteína A/G á mestura do anticorpo e proteína. Neste momento, os anticorpos, que agora están unidos ás súas dianas, vanse adherir ás boliñas.
Desde este momento en adiante, os protocolos directo e indirecto converxen porque as mostras teñen agora os mesmos ingredientes. Ambos os métodos dan o mesmo resultado final coa proteína ou complexos proteicos unidos aos anticorpos que están inmobilizados nas boliñas/doas.
Seleción Ás veces prefírese unha estratexia indirecta cando a concentración da diana proteica é baixa ou cando a afinidade específica do anticorpo pola proteína é débil. O méido indirecto tamén se usa cando a cinética de unión do anticorpo coa proteína é baixa por diversas razóns. Na maioría das situacións, o método directo é a elección preferida por defecto.
Avances tecnolóxicos
Agarosa