Изотопско означување — техника која се употребува за следење на преминот на изотоп (атом со забележлива варијација во бројот на неутрони) преку хемиска реакција, метаболички пат или биолошка клетка. Реагенсот е „означен“ со замена на еден или повеќе специфични атоми со нивните изотопи. На реагенсот потоа му се дозволува да се подложи на реакцијата. Положбата на изотопите во производите се мери за да се одреди која низа следел изотопскиот атом во реакцијата или метаболичкиот пат на клетката. Нуклидите кои се користат во изотопското обележување може да бидат стабилни нуклиди или радионуклиди. Во вториот случај, означувањето се нарекува радиоозначување.
Во изотопското означување, постојат повеќе начини за откривање на присуството на изотопи за обележување; преку нивната маса, вибрационен режим или радиоактивно распаѓање. Масовната спектрометрија ја открива разликата во масата на изотопот, додека инфрацрвената спектроскопија ја открива разликата во вибрационите режими на изотопот. Јадрената магнетна резонанца открива атоми со различни аголномагнетни соодноси. Радиоактивното распаѓање може да се открие преку комора за јонизација или преку авторадиографија.
Пример за користење на изотопско означување е проучувањето на фенолот (C6H5OH) во вода со замена на обичниот водород ( протиум) со деутериум (деутериумско означување). Со додавање на фенол во тешка вода (вода која содржи D2O како додаток на вообичаеното H2O ), се забележува размена на водород-деутериум која влијае на фенолната хидроксилна група (што резултира со C6H5OD), што покажува дека фенолот лесно се подложува на реакции на размена на водород со вода. Главно е засегната хидроксилната група - без катализатор, другите 5 атоми на водород се многу побавно подложени на размена - што ја одразува разликата во хемиските средини помеѓу хидроксилниот водород и арил водородот.
Изотопски трагач мини|300x300пкс| Била искористена ознака за јаглерод-13 за да се одреди механизмот во конверзијата од 1,2- до 1,3-дидехидробензен на фенил супституираниот арински прекурсор 1 во аценафтилен. Изотопски трагач, (исто така „изотопски маркер“ или „изотопска ознака“), се употребува во хемијата и биохемијата за да помогне во разбирањето на хемиските реакции и заемни односи. Во оваа техника, еден или повеќе од атомите на молекулата од интерес се заменуваат со атом од истиот хемиски елемент, но од различен изотоп (како радиоактивен изотоп што се употребува во радиоактивно следење). Бидејќи означениот атом има ист број на протони, тој ќе се однесува речиси на ист начин како неговиот неозначен пандан и, со мали исклучоци, нема да се меша во реакцијата што се истражува. Разликата во бројот на неутрони, сепак, значи дека може да се открие одделно од другите атоми на истиот елемент.
Јадрената магнетна резонанца (ЈМР) и масена спектрометрија (МС) се користат за истражување на механизмите на хемиските реакции. ЈМР и МС откриваат изотопски разлики, што овозможува да се одредат информациите за положбата на означените атоми во структурата на производите. Со информации за позиционирањето на изотопските атоми во производите, може да се одреди патеката на реакцијата што ја употребуваат почетните метаболити за да се претворат во производи. Радиоактивните изотопи може да се тестираат со помош на авторадиографи на гелови во гел електрофореза . Зрачењето испуштено од соединенијата што ги содржат радиоактивните изотопи затемнува парче фотографски филм, снимајќи ја позицијата на означените соединенија една во однос на друга во гелот.
Изотопските трагачи најчесто се употребуваат во форма на сооднос на изотоп. Со иследување на односот помеѓу два изотопи на истиот елемент, се избегнуваат ефектите што го вклучуваат целокупната застапеност на елементот, што обично ги надминува многу помалите варијации во изотопското изобилство. Изотопските трагачи се едни од најважните алатки во геологијата бидејќи можат да се користат за разбирање на сложените процеси на мешање во земјените системи. Понатамошна расправа за примената на изотопските трагачи во геологијата е покриена под насловот на изотопска геохемија.
Изотопските трагачи обично се поделени во две категории: трагачи на стабилни изотопи и трагачи на радиогени изотопи. Стабилните изотопски трагачи вклучуваат единствено нерадиогени изотопи и обично се зависни од масата. Во теорија, секој елемент со два стабилни изотопи може да се употреби како изотопски трагач. Сепак, најчесто користените трагачи на стабилни изотопи вклучуваат релативно лесни изотопи, кои лесно се подложени на фракционирање во природните системи. Радиогенски изотоп трагач вклучува изотоп произведен од радиоактивно распаѓање, кој обично е во сооднос со нерадиоген изотоп (чие изобилство во земјата не варира поради радиоактивното распаѓање).
Стабилно означување на изотоп мини|400x400пкс| Изотопско следење преку реакции во патеката на пентоза фосфат. Сините кругови означуваат означен јаглероден атом, додека белите кругови се неозначен јаглероден атом. Стабилното обележување на изотопи вклучува користење на нерадиоактивни изотопи кои можат да дејствуваат како трагачи што се употребуваат за моделирање на неколку хемиски и биохемиски системи. Избраниот изотоп може да дејствува како ознака на тоа соединение што може да се идентификува преку јадрена магнетна резонанца (ЈМР) и масена спектрометрија (МС). Некои од најчестите стабилни изотопи се 2H, 13C и 15N, кои понатаму може да се произведат во ЈМР-растворувачи, амино киселини, нуклеински киселини, липиди, обични метаболити и медиуми за раст на клетките. Соединенијата произведени со употреба на стабилни изотопи се или специфицирани со процентот на означени изотопи (односно, 30% рамномерно означена 13C гликоза содржи мешавина која е 30% означена со 13 јаглероден изотоп и 70% природно означен јаглерод) или со специфично означено соединението на (односно, -13C гликоза која е означена на првата јаглеродна позиција на гликоза).
Прикажана е мрежа на реакции усвоени од патеката на гликолиза и патеката на пентоза фосфат во која означениот изотоп на јаглерод се преуредува на различни места на јаглерод низ целата мрежа на реакции. Мрежата започнува со фруктоза 6-фосфат (F6P), која има 6 јаглеродни атоми со ознака 13C на јаглеродните места 1 и 2. 1,2−13 C F6P станува два глицералдехид 3-фосфат (G3P), еден 2,3−13 C T3P и еден неозначен T3P. 2,3−13 C T3P сега може да се реагира со седохептулоза 7-фосфат (S7P) за да се формира неозначен еритроза 4-фосфат (E4P) и 5,6−13 C F6P. Необележаниот T3P ќе реагира со S7P за да синтетизира неетикетирани производи. Сликата ја демонстрира употребата на стабилно означување на изотоп за откривање на преуредувањето на јаглеродниот атом преку реакции користејќи означени соединенија специфична за позиција.
Анализа на метаболички флукс со користење на стабилно означување на изотоп
Анализата на метаболичкиот флукс (АМФ) со употреба на стабилно означување на изотоп е важна алатка за објаснување на флуксот на одредени елементи низ метаболичките патишта и реакции во клетката. Изотопска ознака се внесува во клетката, а потоа на клетката и се дозволува да расте користејќи ја означената храна. За анализа на стационарниот метаболички флукс клетката мора да достигне стабилна состојба (изотопите што влегуваат и излегуваат од клетката остануваат константни со времето) или квазистабилна состојба (стабилна состојба се постигнува за даден временски период).. Се одредува изотопски модел на излезниот метаболит. Моделот на излезниот изотоп обезбедува вредни информации, кои може да се употребат за да се пронајде големината на флуксот, стапката на конверзија од реагенсите во производи, преку секоја реакција.
Сликата ја покажува способноста да се употребат различни ознаки за да се одреди флуксот преку одредена реакција. Со претпоставка дека оригиналниот метаболит, соединение со три јаглерод, има способност или да се подели на два јаглеродни метаболити и еден јаглероден метаболит во една реакција, потоа да се рекомбинира или да остане метаболит со три јаглерод. Доколку реакцијата е снабдена со два изотопи на метаболитот во еднаков сооднос, еден целосно означен (сини кругови), попознат како униформно означен и еден целосно неозначен (бели кругови). Патеката по левата страна на дијаграмот не прикажува никаква промена во метаболитите, додека десната страна ги прикажува разделувањето и рекомбинацијата. Како што е прикажано, доколку метаболитот го следи патот само по левата страна, тој останува во сооднос 50-50 на рамномерно означен со неозначен метаболит. Доколку метаболитот ја заземе само десната страна, може да се појават нови модели за означување, сите во еднаков сооднос. Може да се појават други соодноси во зависност од тоа колку од оригиналниот метаболит ја следи левата страна на патеката наспроти десната страна на патеката. Овде пропорциите се прикажани за ситуација во која половина од метаболитите ја земаат левата страна, а половина десната, но може да се појават други соодноси. Овие модели на означени атоми и неозначени атоми во едно соединение претставуваат изотопомери. Со мерење на распространетост на изотопомер на различно означените метаболити, може да се одреди флуксот низ секоја реакција.
АМФ ги комбинира податоците собрани од означување на изотоп со стехиометријата на секоја реакција, ограничувањата и процедурата за оптимизација ја решаваат картата на флукс. IR- реверзибилните реакции ги обезбедуваат топлинско-динамичките ограничувања потребни за пронаоѓање на флуксовите. Изградена е матрица која ја содржи стехиометријата на реакциите. Интрацелуларните флукси се проценуваат со употреба на итеративен метод во кој симулираните флукси се вклучени во стехиометрискиот модел. Симулираните текови се прикажани во карта на флукс, која ја покажува брзината на реагенсите кои се претвораат во производи за секоја реакција. Во повеќето флукс мапи, колку е подебела стрелката, толку е поголема вредноста на флуксот на реакцијата.
Техники за мерење на означување
Може да се користи која било техника за мерење на разликата помеѓу изотопомерите. Двата примарни методи, јадрена магнетна резонанца (ЈМР) и масена спектрометрија (МС), се развиени за мерење на изотопомери на маса во стабилно означување на изотопи.
Протонската ЈМР станала првата техника што се користела за 13C експерименти за означување. Користејќи го овој метод, секоја поединечна положба на протониран јаглерод во одреден метаболитски базен може да се набљудува одделно од другите местоположби. Ова овозможува да се знае процентот на изотопомери означени на таа специфична позиција. Границата на ЈМР на протонот е дека ако има n атоми на јаглерод во метаболит, може да има само најмногу n различни позициони вредности на збогатување, што е само мал дел од вкупните информации за изотопомер. Иако употребата на означување на протонски ЈМР е ограничена, експериментите со чист протонски ЈМР се многу полесни за евалуација отколку експериментите со повеќе информации за изотопомери.
Во прилог на протон ЈМР, користењето на 13C ЈМР техники ќе овозможи подетален преглед на распространетост на изотопомерите. Обележаниот јаглероден атом ќе произведе различни хиперфини сигнали за разделување во зависност од состојбата на означување на неговите директни соседи во молекулата. Се појавува единечен врв доколку соседните јаглеродни атоми не се означени. Врвот на дублет се појавува ако е означен само еден соседен јаглероден атом. Големината на дублетот зависи од функционалната група на соседниот јаглероден атом. Доколку два соседни јаглеродни атоми се означени, двоен дублет може да се дегенерира во тројка ако разделите на дублети се еднакви..