Transcriptomul este ansamblul tuturor moleculelor de ARN (transcrise) dintr-o celulă sau dintr-o populație de celule. Acesta include toate moleculele de ARN funcționale, precum și toate celelalte transcrise care pot apărea prin transcriere spurioasă sau prin transcrierea unor regiuni nefuncționale, cum ar fi sau fragmentele de virusuri. Un obiectiv major al biologiei moleculare moderne este de a determina care transcrise sunt funcționale și care reprezintă ARN rezidual (junk ARN).

Termenul transcriptom este un cuvânt-valiză (portmanteau) format din cuvintele transcript și genom; el este asociat cu procesul de producere a transcriselor în cadrul procesului biologic de transcripție. Partea funcțională a transcriptomului este dinamică — se modifică în funcție de tipul celular, stadiul de dezvoltare, mediu și stimuli — și reprezintă, prin urmare, starea activă a expresiei genice, nu secvența statică de ADN (genomul).

Transcriptomurile eucariote tind să fie mai complexe decât transcriptomurile bacteriene, iar transcriptomurile eucariotelor pluricelulare sunt și mai complexe decât cele ale eucariotelor unicelulare.

Etimologie și istorie Cuvântul transcriptom este un cuvânt telescopat format din termenii transcript și genom. A apărut alături de alte neologisme formate cu sufixele -om și -omică, pentru a desemna studii realizate la scară genomică în domeniile științelor vieții și tehnologiei. Astfel, transcriptomul și transcriptomica au fost printre primele concepte apărute, alături de genom și proteom. Prima lucrare care a prezentat un caz de colectare a unei biblioteci de pentru ARN mesager (ARNm) de la viermele de mătase a fost publicată în 1979. Prima lucrare fundamentală care a menționat și a investigat transcriptomul unui organism a fost publicată în 1997 și a descris 60.633 de transcrise exprimate în folosind (SAGE).

Odată cu apariția tehnologiilor de mare capacitate (high-throughput), a bioinformaticii și a creșterii puterii de calcul, caracterizarea și analiza unor volume enorme de date au devenit din ce în ce mai eficiente și mai facile. Încercările de caracterizare a transcriptomului au devenit mai proeminente odată cu apariția secvențierii automate a ADN-ului în anii 1980. În anii 1990, secvențierea a fost utilizată pentru identificarea genelor și a fragmentelor acestora. Ulterior, au fost dezvoltate tehnici precum analiza serială a expresiei genice (SAGE), (CAGE) și (MPSS).

Transcripția Transcriptomul cuprinde toate transcrisele de acid ribonucleic (ARN) prezente într-un organism sau într-un eșantion experimental dat. Componenta funcțională a transcriptomului include ARN-urile care poartă informația genetică responsabilă de procesul de transformare a ADN-ului în fenotipul unui organism. O genă dă naștere unei molecule de ARN monocatenar printr-un proces molecular cunoscut sub numele de transcripție; acest ARN este complementar catenei de ADN din care provine. Enzima ARN-polimerază se atașează de catena matriță de ADN și catalizează adăugarea de ribonucleotide la capătul 3′ al secvenței în creștere a transcrisului de ARN.

Pentru a-și iniția funcția, ARN-polimeraza trebuie să recunoască o , localizată în apropierea situsului de inițiere a transcripției, care definește începutul genei. Acest proces este de obicei mediat și reglat de factori de transcripție. Transcripția se încheie la un situs terminator care definește celălalt capăt al genei; acest situs este adesea identificat prin secvențe de terminare.

Tipuri de transcrise ARN

Aproape toate transcrisele funcționale provin din gene cunoscute. Singurele excepții sunt un număr mic de transcrise care pot juca un rol direct în reglarea expresiei genice în apropierea promotorilor genelor cunoscute (vezi ).

Genele ocupă cea mai mare parte a genomurilor procariote, astfel încât cea mai mare parte a acestora este transcrisă. Multe genomuri eucariote sunt foarte mari, iar genele cunoscute pot ocupa doar o fracțiune din genom. La mamifere, de exemplu, genele cunoscute reprezintă doar 40–50% din genom. Cu toate acestea, transcrisele identificate se mapează adesea pe o fracțiune mult mai mare a genomului, sugerând că transcriptomul conține numeroase transcrise spurioase care nu provin din gene. Unele dintre aceste transcrise sunt cunoscute ca fiind nefuncționale, deoarece se mapează pe transcrise sau pe degenerați și virusuri. Altele se mapează pe regiuni neidentificate ale genomului, care pot reprezenta .

Transcrierea spurioasă este foarte frecventă la eucariote, în special la cele cu genomuri mari, care pot conține cantități considerabile de ADN rezidual. Unii oameni de știință susțin că, dacă unui transcript nu i-a fost atribuită o genă cunoscută, presupunerea implicită ar trebui să fie că acesta este ARN rezidual până când se demonstrează că este funcțional. Aceasta ar însemna că o mare parte din transcriptomul speciilor cu genomuri mari este probabil ARN rezidual (vezi ).

Transcriptomul include transcrisele genelor codante de proteine (ARNm plus introni), precum și transcrisele genelor necodante (ARN-uri funcționale plus introni).

ARN ribozomal / rARN: de obicei cel mai abundent ARN din transcriptom. / lncARN: transcrise ARN necodante mai lungi de 200 de nucleotide. Membrii acestui grup constituie cea mai mare fracțiune a transcriptomului necodant, cu excepția intronilor. Nu se cunoaște câte dintre aceste transcrise sunt funcționale și câte reprezintă ARN rezidual (junk ARN). ARN de transfer / tARN microARN / miARN: 19–24 nucleotide (nt). MicroARN-urile reglează pozitiv sau negativ nivelurile de expresie ale ARNm prin procesul de la nivel post-transcripțional. ARN interferent mic / siARN: 20–24 nt / snoARN / piARN: 24–31 nt. Interacționează cu din familia și au rol în țintirea și clivarea transpozonilor. / eARN

Domeniul de studiu În genomul uman, toate genele sunt transcrise în ARN, deoarece aceasta este definiția moleculară a unei gene (vezi Genă). Transcriptomul este alcătuit din regiunile codante ale ARNm, plus regiunile necodante (UTR), introni, ARN-uri necodante și transcrise spurioase nefuncționale.

Mai mulți factori fac ca stabilirea conținutului transcriptomului să fie dificilă. Aceștia includ splicing alternativ, și transcripția alternativă, printre altele. În plus, tehnicile transcriptomice pot surprinde transcripția care are loc într-o probă la un moment specific, deși conținutul transcriptomului se poate modifica în timpul diferențierii. Principalele obiective ale transcriptomicii sunt următoarele: „catalogarea tuturor speciilor de transcrise, inclusiv ARNm, ARN-uri necodante și ARN-uri mici; determinarea structurii transcripționale a genelor, în termeni de situsuri de inițiere, capete 5′ și 3′, tipare de splicing și alte modificări post-transcripționale; și cuantificarea nivelurilor de expresie în schimbare ale fiecărui transcript în timpul dezvoltării și în condiții diferite”.

Termenul poate fi aplicat setului total de transcrise dintr-un anumit organism sau unui subset specific de transcrise prezente într-un anumit tip celular. Spre deosebire de genom, care este relativ fix pentru o linie celulară dată (excluzând mutațiile), transcriptomul poate varia în funcție de condițiile externe de mediu. Deoarece include toate transcrisele de ARNm din celulă, transcriptomul reflectă genele care sunt exprimate activ la un moment dat, cu excepția fenomenelor de degradare a ARNm, cum ar fi . Studiul (care include , analiza variantelor de splicing etc.) examinează nivelul de expresie al ARN-urilor într-o populație celulară dată, adesea concentrându-se pe ARNm, dar uneori incluzând și altele, precum tRNA-urile și sRNA-urile.

Metode de construire

Transcriptomica este știința cantitativă care presupune atribuirea unei liste de șiruri („citiri”/reads) unor obiecte („transcrise” din genom). Pentru a calcula nivelul de expresie, se numără densitatea citirilor corespunzătoare fiecărui obiect. Inițial, transcriptomurile au fost analizate și studiate folosind biblioteci de (EST) și tehnici precum analiza serială a expresiei genice (SAGE).

În prezent, cele două principale sunt și ARN-Seq. Ambele tehnici necesită izolarea ARN-ului prin metode de extracție ARN, urmată de separarea acestuia de alte componente celulare și îmbogățirea ARNm.

Există două metode generale de deducere a secvențelor transcriptomului. O abordare mapează citirile de secvență pe un genom de referință, fie al organismului studiat, fie al unei specii apropiate. Cealaltă abordare, , utilizează software pentru a deduce direct transcrisele din citiri scurte de secvență și este folosită la organisme ale căror genomuri nu sunt secvențiate.

Microarray-uri ADN

thumb| utilizat pentru detectarea expresiei genelor în probe umane (stânga) și de șoarece (dreapta) Primele studii de transcriptom s-au bazat pe tehnici de microarray (cunoscute și sub denumirea de cipuri ADN). Microarray-urile constau din lame subțiri de sticlă pe care sunt dispuse puncte ce conțin , numite „sonde”; fiecare punct conține o secvență ADN cunoscută.

În analiza microarray, ARNm este colectat dintr-o probă martor și una experimentală, aceasta din urmă fiind de obicei reprezentativă pentru o boală. ARN-ul de interes este convertit în ADNc pentru a-i crește stabilitatea și este marcat cu de două culori, de regulă verde și roșu, pentru cele două grupuri. ADNc-ul este apoi aplicat pe suprafața microarray-ului, unde se hibridizează cu oligonucleotidele de pe cip, iar un laser este utilizat pentru scanare. Intensitatea fluorescenței la fiecare punct corespunde nivelului de expresie genică, iar pe baza culorii fluoroforilor se poate determina care probă prezintă niveluri mai ridicate ale ARNm de interes.

Un microarray conține de obicei suficiente oligonucleotide pentru a reprezenta toate genele cunoscute; totuși, datele obținute prin microarray nu oferă informații despre gene necunoscute. În anii 2010, microarray-urile au fost aproape complet înlocuite de tehnici de nouă generație bazate pe secvențierea ADN.

Secvențierea ARN

Secvențierea ARN este o tehnologie de ; ca atare, necesită doar o cantitate mică de ARN și nu presupune cunoașterea prealabilă a genomului. Aceasta permite atât analiza calitativă, prin descoperirea de transcrise noi, cât și analiza cantitativă, prin măsurarea cantităților relative ale transcriselor dintr-o probă.

Cele trei etape principale ale secvențierii transcriptomului pentru orice probă biologică includ purificarea ARN-ului, sinteza unei biblioteci de ARN sau ADNc și secvențierea bibliotecii. Procesul de purificare a ARN-ului diferă pentru ARN-urile scurte și cele lungi. Această etapă este urmată, de obicei, de evaluarea calității ARN-ului, pentru a evita contaminanți precum ADN-ul sau contaminanți tehnici rezultați din procesarea probei. Calitatea ARN-ului este măsurată prin spectrometrie UV, cu un vârf de absorbție la 260 nm. Integritatea ARN-ului poate fi analizată și cantitativ prin compararea raportului și intensității față de , exprimate prin scorul RIN (RNA Integrity Number).

Deoarece ARNm este specia de interes și reprezintă doar aproximativ 3% din conținutul total de ARN, proba trebuie tratată pentru a elimina rARN și tARN, precum și transcrisele ARN specifice țesutului.

Etapa de pregătire a bibliotecii, care are ca scop obținerea de fragmente scurte de ADNc, începe cu fragmentarea ARN-ului în transcrise cu lungimi cuprinse între 50 și 300 de perechi de baze. Fragmentarea poate fi enzimatică (prin endonuclează ARN), chimică (tampon cu săruri de trismagneziu, hidroliză chimică) sau mecanică (sonicare, nebulizare). este utilizată pentru a converti șabloanele de ARN în ADNc, iar pentru aceasta pot fi folosite trei metode de inițiere: oligo-dT, primeri aleatori sau ligarea unor oligonucleotide adaptor speciale.

Transcriptomică la nivel de celulă unică