Биоортогональные реакции — химические реакции, которые способны протекать внутри живых систем, не мешая естественным биохимическим процессам. Функциональные группы, участвующие в биоортогональных реакциях, как правило, не встречаются в биомолекулах, быстро и селективно реагируют друг с другом в условиях живой клетки и при этом являются инертными по отношению к другим соединениям, которые присутствуют в организме. Термин был предложен Каролин Бертоцци в 2003 году. Название реакций основано на переносном значении слова «ортогональный», то есть независимый от чего-либо, и обозначает взаимную независимость протекания искусственных и естественных процессов.

Несмотря на то, что в области органической химии открыто, изучено и описано большое множество химических реакций, практически ни одна из них не может быть проведена в клетке или организме так, чтобы затронуть лишь интересующее исследователя соединение (белок, ДНК, метаболит и др.). Так происходит потому, что биомолекулы содержат большое количество весьма похожих по реакционной способности функциональных групп (преимущественно нуклеофильных), и реакция, в которую вступает изучаемое соединение, неизбежно затронет и другие молекулы, содержащие подобные функциональные группы, что может не только не соответствовать задачам исследования, но и нарушать естественную работу клетки, делая невозможным её изучение. В то же время проведение химических реакций внутри клетки является полезным инструментом исследования, поскольку позволяет помечать исследуемые биомолекулы флуоресцентными, аффинными и масс-спектрометрическими метками, которые в дальнейшем позволят наблюдать эти биомолекулы соответствующими методами исследования, например, при помощи флуоресцентного микроскопа. Биоортогональные реакции призваны заполнить этот пробел, поскольку они являются абсолютно чуждыми клетке, протекают между искусственно вводимыми функциональными группами и мало влияют на работу клетки.

Использование биоортогональной реакции на практике обычно осуществляют в две стадии. Сначала изучаемое соединение модифицируют биоортогональной функциональной группой внутри клетки. Затем в систему вводят низкомолекулярную метку, содержащую комплементарную функциональную группу, и в результате биоортогональной реакции происходит селективная модификация (мечение) данного соединения. В дальнейшем введённая метка позволяет наблюдать за модифицированным субстратом.

В настоящее время при помощи биоортогональных реакций стало возможным изучение различных биомолекул, например, гликанов, белков и липидов, в режиме реального времени в живых системах при отсутствии цитотоксичности. Было разработано несколько химических реакций, отвечающих требованиям биоортогональности, среди них азидов к циклооктинам (называемое также безмедной клик-реакцией), нитронов к циклооктинам, образование оксимов или гидразонов из карбонильных соединений, реакция тетразинов с циклооктенами, клик-реакция изонитрилов и квадрициклановое лигирование.

История Первое наблюдение селективной ковалентной модификации при помощи химической реакции в условиях клетки появилось в работе Р. Цяня и сотр., которые использовали флуоресцеин с двумя арсиновыми функциональными группами для селективной модификации белка, в который заранее вводили тетрацистеиновый фрагмент, практически отсутствующий в белках млекопитающих. Данный подход позволил ввести в белок флуоресцентную метку небольшого размера, в то время как стандартным методом того времени было получение гибридов с зелёным флуоресцентным белком или его аналогами, обладающими значительно бо́льшим размером и, как следствие, порою мешающими нормальному функционированию исследуемого белка.

Данный подход побудил химиков искать химические реакции и функциональные группы, абсолютно чуждые природным соединениям, а биологов — изобретать пути введения биоортогональных функций в биомолекулы. Первым шагом стало осознание того, что биомолекулы содержат, в основном, нуклеофильные группы, в то время как электрофильные группы в них встречаются гораздо реже. Например, кетоны и альдегиды не встречаются в белках, в то же время они проявляют реакционную способность по отношению к гидразидным и оксиаминным группам, которые также не встречаются в биомолекулах. Благодаря этому, в конце 1990-х годов стала возможной модификация гликанов и белков через метаболически введённые кетон-содержащие сахара и аминокислоты внутри клетки. Кетоны и альдегиды, однако, присутствовали в низкомолекулярных метаболитах (сахара, пируват, пиридоксальфосфат и др.), то есть не были полностью биоортогональными.

В дальнейшем химики вели поиск биоортогональных реакций, протекающих между совершенно неприродными функциональными группами. Реакция Штаудингера стала первой химической реакцией, приспособленной для проведения модификаций внутри клетки. Азидная группа, вступающая в данную реакцию, относится к мягким электрофилам, которые не способны реагировать с жёсткими нуклеофилами, наиболее распространёнными в природе. Партнёром для азида стал фосфин — мягкий нуклеофил, предложенный Г. Штаудингером в 1919 году. В 2000 году реакция Штаудингера была модифицирована К. Бертоцци и применена как биоортогональное лигирование по Штаудингеру для мечения широкого спектра биомолекул как в живых клетках, так и целых организмах.

В это же время стала развиваться клик-химия — химическая концепция, описывающая получение библиотек органических соединений при помощи быстрых и надёжных реакций, позволяющих собирать молекулы из небольших строительных блоков. Среди нескольких реакций, удовлетворяющих данной концепции, азид-алкиновое циклоприсоединение, катализируемое медью, нашло широчайшее применение для модификации биомолекул in vitro. Однако из-за токсичности медного катализатора такая реакция не могла быть использована в живых клетках или организмах. Группа К. Бертоцци создала некаталитический вариант данной реакции, известный как азид-алкиновое циклоприсоединение, облегчаемое напряжением (SPAAC), являющийся перспективной биоортогональной реакцией.

В настоящее время продолжается поиск новых биоортогональных реакций с целью получить возможность проведения параллельной модификации субстратов в одной и той же биологической системе.

Условия биоортогональности В идеальном случае биоортогональная реакция должна соответствовать следующим частным условиям: Селективность. Реакция должна протекать селективно между функциональными группами во избежание побочных процессов с участием биологических соединений. Биологическая инертность. Реагирующие группы и образующаяся связь не должны в какой-либо мере обладать реакционной способностью, способной нарушить естественные процессы, протекающие в изучаемом организме. Химическая инертность. Образующаяся ковалентная связь должна быть прочной и инертной по отношению к среде протекания реакции. Высокая скорость. Реакция должна быть быстрой, чтобы модификация наступила до расщепления или выведения метки из организма. Благодаря малому времени отклика быстрые реакции могут быть использованы для точного слежения за динамическими процессами в режиме реального времени. Биосовместимость. Реакция должна быть нетоксичной и протекать в биологических условиях, то есть при определенном рН, температуре и в водной среде. Доступная модификация субстрата. В идеальном случае биоортогональная функциональная группа должна вводиться в биомолекулу в ходе метаболизма или методами белковой инженерии. Функциональная группа должна быть небольшого размера и не нарушать нативное состояние биомолекулы.

Лигирование по Штаудингеру

Данная реакция была разработана группой К. Бертоцци в 2000 году на основе классической реакции Штаудингера между азидами и триарилфосфинами. Эта реакция стала родоначальником области биоортогональной химии, поскольку реагирующие в ней группы (азиды, фосфины) не представлены в биомолекулах, однако теперь она не используется так же широко. Лигирование по Штаудингеру было использовано для модификации биомолекул как в живых клетках, так и в мышах.

Биоортогональность В реакции Штаудингера азидная группа выступает как мягкий электрофил, реагируя с такими мягкими нуклеофилами, как фосфины. Большинство биологических нуклеофилов, напротив, являются жёсткими нуклеофилами, которые в реакцию с азидами не вступают. Кроме того, лигирование по Штаудингеру протекает в водной среде с образованием стабильного продукта.

Фосфины отсутствуют в природных биомолекулах и не восстанавливают дисульфидные связи.

На примере лекарственных препаратов (азидотимидин) было показано, что азиды являются биосовместимыми. Маленький размер азидной группы позволяет легко вводить её в биомолекулы метаболическими путями.

Механизм В основе реакции Штаудингера лежит нуклеофильная атака фосфина на концевой атом азота азидной группы с образованием фосфазида 1. Затем происходит превращение фосфазида 1 в иминофосфоран 3, сопровождающееся выделением азота, после чего наступает гидролиз иминофосфорана с образованием амина и фосфиноксида. Для применения в области биоконъюгации реакция была изменена путём введения сложноэфирной группы в орто-положение одного из арильных заместителей фосфина. В результате атаки образующегося иминофосфорана 3 на эту группу образуется бициклический продукт 4, гидролиз которого приводит к образованию устойчивой амидной связи между субстратом и вводимой меткой. Лимитирующей стадией реакции является атака молекулой фосфина азидной группы.

Ограничения Основной недостаток данной реакции заключается в том, что фосфины медленно окисляются кислородом в живых системах. Кроме того, они, вероятно, метаболизируются цитохромами P450. Лигирование по Штаудингеру протекает достаточно медленно, согласно кинетике второго порядка, с константой скорости около 0,0020 М−1 с−1. Попытки ускорить нуклеофильную атаку введением электронодонорных групп в арильные заместители приводят к ускорению реакции, но также увеличивается и скорость окисления фосфинов.

Низкая скорость реакции требует увеличения концентрации используемого фосфина, из-за чего усиливается фоновый сигнал, производимый избыточным содержанием метки. Предпринимались усилия для преодоления этой проблемы: были синтезированы флуорогенные фосфины на основе флуоресцеина и кумарина, действие которых основано на разгорании флуоресценции лишь после встраивания в биомолекулу, что позволяло получить больший скачок интенсивности излучения в результате протекания реакции. В данное время кинетика реакции остаётся серьёзным препятствием для её широкого использования.

Безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение

Безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение — это биоортогональная реакция, разработанная К. Бертоцци как активированный вариант реакции Хьюсгена. В отличие от азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого медью (CuAAC, Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition), данный вариант реакции протекает с более высокой скоростью за счёт снятия углового напряжения в молекуле циклооктина при образовании продукта присоединения. Поэтому эта реакция получила известность как азид-алкиновое циклоприсоединение, облегченное напряжением (SPAAC, Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition). Данная модификация позволяет избежать использования токсичного медного катализатора и использовать безмедную реакцию в живых клетках и организмах.

Токсичность меди Классическое азид-алкиновое циклоприсоединение, катализируемое медью, является очень быстрой и эффективной реакцией для биоконъюгации, однако оно не может быть использовано в живых клетках из-за токсичности ионов Cu+. Токсичность объясняется образованием активных форм кислорода, генерируемых медными катализаторами.

Проводилась оптимизация лигандов для предотвращения вредного воздействия на биомолекулы, однако было показано, что различное лигандное окружение в комплексах также влияет на метаболизм, так как вносит нежелательные изменения в клеточные процессы.

Биоортогональность