Paleoxenómica

A paleoxenómica é un campo da ciencia dedicado á reconstrución e análises de información xenómica de especies extintas. A mellora nos métodos de extracción de ADN antigo (ADNa ou aDNA) de mostras gardadas en museos, núcleos de xeo, sitios arqueolóxicos e paleontolóxicos, e as tecnoloxías de secuenciación de seguinte xeración aceleraron os avances neste campo. Agora é posible detectar a deriva xenética, a migración de poboacións antigas e as súas interrelacións, a historia evolutiva de plantas, animais e especies de Homo extintas e a identificación de características fenotípicas en distintas rexións xeográficas. A paleoxenómica pode utilizarse para comparar os antepasados antigos con humanos actuais. A crecente importancia da paleoxenómica é evidente polo feito da concesión do premio Nobel de Medicina e Fisioloxía de 2022 ao xenetista sueco Svante Pääbo [1955-], que traballou en paleoxenómica.

Introdución

Inicialmente, a secuenciación de ADNa requiría clonar pequenos fragmentos de ADN en bacterias, o cal se producía con baixa eficiencia debido aos danos oxidativos sufridos polo ADNa ao longo dos milenios. O ADNa é difícil de analizar debido á súa doada degradación por encimas nucleases, pero os ambientes específicos e certas condicións post-mortem melloraron o illamento e a análise. Eran necesarios estritos protocolos de extracción e evitación da contaminación para poder facer análises fiables. Co desenvolvemento da reacción en cadea da polimerase (PCR) en 1983, os científicos podían estudar mostras de ADN de ata aproximadamente 100.000 anos de antigüidade, unha limitación debida aos fragmentos relativamente curtos illados. Cos avances en illamento, amplificación, secuenciación e reconstrución de datos, puideron analizarse mostras cada vez máis antigas. Nos últimos 30 anos, a análise do ADN mitocondrial de alto número de copias serviu para responder moitas preguntas; a chegada das técnicas de secuenciación de seguinte xeración permitiu ir máis lonxe. Ademais, esta revolución tecnolóxica permitiu a transición da paleoxenética á paleoxenómica.

Métodos de secuenciación

Dificultades e técnicas A PCR, a secuenciación de seguinte xeración e varios métodos de biblioteca de ADN están dispoñibles para a secuenciación do ADNa, ademais de moitas ferramentas bioinformáticas. Cando se utiliza calquera destes métodos é importante considerar que o ADNa pode ser alterado post-mortem. As alteracións específicas orixínanse por: Datos de secuencias de padróns mutacionais de bases (mutación C→T). Enlaces cruzados. Desaminación de citosinas. Despurinación. Fragmentación do xenoma.

Os padróns específicos e o comezo destas alteracións axudan aos científicos a estimar a idade da mostra.

Anteriormente, os científicos diagnosticaban os danos post-mortem usando reaccións encimáticas ou cromatografía de gas asociadas con espectrometría de masas; en anos máis recentes empezouse a detectalos aproveitando os datos de secuencias mutacionais. Esta estratexia permite identificar o exceso de mutacións C→T despois do tratamento con uracilo ADN glicosilase. Hoxe en día, úsase a secuenciación de alto rendemento (HTS) para identificar a despurinación (un proceso que orixina fragmentación do ADN post-mortem, no que as mostras máis novas presentan máis adenina que guanina), roturas de febra simple na dobre hélice do ADN e sitios abásicos (creados por mutacións C→T). Un fragmento de ADNa pode secuenciarse en toda a súa lonxitude con HTS. Con estes datos pode crearse unha distribución que represente unha curva de dacaemento de tamaño que permita unha comparación cuantitativa directa da fragmentación en espécimes analizados en diversas condicións. Por medio desta curva é posible obter a lonxitude media dun determinado fragmento de ADNa. Esta lonxitude reflicte o nivel de fragmentación despois da morte, que se incrementa xeralmente coa temperatura deposicional.Orlando L., Gilbert MT., Willerslev E. 2015. Reconstructing ancient genomes and epigenomes. Nat. Rev. Genet. 16(7):395-408.

Bibliotecas

Poden realizarse dous tipos de bibliotecas para a secuenciación de ADNa usando a PCR para a amplificación do xenoma: Biblioteca de ADNa bicatenario. Biblioteca de ADNa monocatenario.

A primeira créase usando a estratexia de extremos romos. Esta técnica usa diferentes adaptadores: estes adaptadores únense aleatoriamente ao fragmento e este pode despois ampliarse. O fragmento que non contén ambos os adaptadores non pode ser ampliado xerando unha fonte de erros. Para reducir este erro introduciuse a ligazón T/A da empresa Illumina: este método consiste en inserir unha cola A na mostra de ADN para facilitar a ligazón da T da cola dos adaptadores. Nestes métodos optimízase a amplificación do ADNa.

Para obter libraría de ADN bicatenario, primeiro desnaturalízase o ADN con calor. O ADN bicatenario obtido lígase despois a dous adaptadores para xerar a febra complementaria e finalmente aplícase a PCR.

Enriquecemento de ADNa Como o ADNa pode conter ADN bacteriano ou doutros microorganismos, o proceso require o seu enriquecemento. Para separar as fraccións endóxenas e exóxenas, empréganse varios métodos: Enriquecemento de molde danado: Usado cando se constrúen bibliotecas de ADN bicatenario porque este método ten como diana o ADN danado. Cando a polimerase Bst enche a mosega, a mostra trátase con uracilo ADN glicosilase e endonuclease VIII. Estes compostos atacan o sitio abásico. O ADN non danado permanece unido ás bólas paramagnéticas cubertas de estreptavidina e pode ser separado da mostra. Este método é específico para mostras de neandertais do Plistoceno tardío. Enriquecemento de diana libre de extensión en solución: este método está baseado na hibridación diana-sonda. Este método require a desnaturalización do ADN e despois insire sondas como tellas solapadas ao longo das rexións diana. Despois, úsase unha PCR para a amplificación do ADN e finalmente o ADN lígase a un adaptador biotinilado. É útil para mostras de antepasados homininos arcaicos. Enriquecemento de diana de fase sólida: neste método utilízanse os microarrays e o método da PCR en tempo real en paralelo cun cribado de secuenciación de escopeta (shotgun). Enriquecemento de xenoma completo: usado para a secuenciación de xenomas enteiros de determinados indviduos. Utilízase a captura en solución de xenoma completo (WISC, Whole-genome In-Solution Capture). Este método empeza coa preparación dunha biblioteca de sonda de ARN de todo o xenoma dunha especie que está estreitamente relacionada co xenoma diana da mostra de ADN.

Diversificación das poboacións non africanas actuais e humanos anatomicamente modernos

Polo momento, moitos estudos en diferentes campos chegaron á conclusión de que as poboacións actuais humanas non africanas son o resultado da diversificación en varias liñaxes dunha metapoboación ancestral ben estruturada, que foi a protagonista da expansión fóra de África, a cal portaba un subconxunto de herdanza xenética africana. Neste contexto, a análise do ADN antigo foi fundamental para comprobar a hipótese xa formulada e proporcionar novas ideas. Primeiro, permitiu estreitar o momento e a estrutura deste fenómeno de diversificación ao proporcionar a calibración da taxa de mutación autosómica e mitocondrial.Skoglund P. and Mathieson I. 2018. Ancient genomics of modern humans: the first decade. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 19:1, 381-404. A análise de mestura xenética demostrou que ocorreron polo menos dous episodios de fluxo xenético independentes entre os devanceiros dos humanos modernos e os humanos arcaicos, como as poboacións neandertais e denisovanas, testemuñando o modelo de "substitución permeable" ("leaky replacement") da historia da poboación humana de Eurasia. Segundo todos estes datos, a diverxencia humana das liñaxes non africanas ocorreu arredor de hai 45.000 – 55.000 anos. Ademais, en moitos casos o ADN antigo permitiu rastrexar os procesos históricos que levaron, co tempo, á estrutura xenética da poboación actual, que sería difícil de establecer contando só coa análise dos xenomas actuais. Entre estas cuestións aínda sen resolver, algunhas das máis estudadas son a identidade dos primeiros habitantes de América, o poboamento de Europa e a orixe da agricultura en Europa.Lan T. and Lindqvist C. 2018. Paleogenomics: Genome-Scale Analysis of Ancient DNA and Population and Evolutionary Genomic Inferences. In: Population Genomics, Springer, Cham. pp 1-38.

Variación fenotípica en humanos

A análise do ADN antigo permite estudar as mutacións de trazos fenotípicos consecuencia dos cambios no ambiente e no comportamento humano. A migración a novos hábitats, novos cambios na dieta (despois da transición á agricultura) e a constución de grandes comunidades levou á exposición dos humanos ás novas condicións que finalmente terían como resultado unha adaptación biolóxica.

Cor da pel A migración dos humanos fóra de África a latitudes máis altas supuxo unha menor exposición á luz solar. Como os raios ultravioleta A e B son esenciais para a síntese de vitamina D, a cal regula a absorción de calcio e é fundamental para a saúde ósea, vivir en latitudes altas significaría unha substancial redución na síntese de vitamina D. Isto puxo unha nova presión selectiva sobre o carácter da cor da pel, favorecendo cores da pel máis claras nas latitudes máis altas. Os dous xenes máis importantes implicados na pigmentación da pel son SLC24A5 e SLC45A2. Hoxe en día, os alelos de “pel clara” destes xenes están fixados en Europa, pero adquiriron unha frecuencia relativamente maior máis recentemente (hai uns 5.000 anos). Este lento proceso de despigmentación suxire que os europeos antigos puideron sufrir os inconvenientes dunha baixa produción de vitamina D, como a aparición de condicións patolóxicas musculoesqueléticas e cardiovasculares. Outra hipótese é que os europeos previos á etapa agrícola puideron conseguir a vitamina D que precisaban da súa dieta, xa que a carne e peixe conteñen certa cantidade de vitamina D.Marciniak S., Perry G. H. Harnessing ancient genomes to study the history of human adaptation. Nature Reviews Genetics volume 18, pages 659–674 (2017)

Adaptación á dieta agrícola

Un dos maiores exemplos de adaptación despois do cambio á dieta agrícola e gandeira é a persistencia da produción do encima lactase durante a etapa adulta. Este encima é esencial para dixerir a lactosa, azucre presente no leite e produtos lácteos, e a ausencia deste encima pode causar diarrea despois de consumir estes produtos. A persistencia da lactase está determinada predominantemente por unha mutación dunha soa base no xene MCM6 e os datos de ADN antigo mostran que esta mutación fíxose común só nos últimos 5.000 anos, miles de anos despois do comezo das prácticas de obtención de leite dos animais. Así, incluso no caos da persistencia da lactase hai un enorme atraso temporal entre o comezo dun novo hábito e o espallamento do alelo adaptativo, polo que pode que o consumo de leite estivese daquela restrinxido aos nenos ou a produtos que tiñan pouca lactosa.

Outro exemplo de mutación seleccionada positivamente polo cambio á agricultura é o número de copias do xene AMY1. O AMY1 codifica o encima amilase, que dixire o amidón, o cal está presente na saliva e os humanos modernos teñen un número maior de copias dese xene comparados cos chimpancés.

O sistema inmunitario