miniatura|upright=1.25|alt=mecanismo do splicing de proteínas no que están implicadas as inteínas|O mecanismo do splicing de proteínas implica as inteínas. Neste esquema, a N-exteína móstrase en vermello, a inteína en negro, e a C-exteína en azul. X representa ou un átomo de oxíxeno ou de xofre. Unha inteína é un segmento dunha proteína que se pode escindir por si mesma da cadea proteica e volve a unir as porcións restantes (as exteínas) por medio dun enlace peptídico. O concepto de inteína/exteína nas proteínas é en gran medida análogo ao concepto intrón/exón nos xenes, polo que as inteínas foron chamadas os "intróns das proteínas".
O empalme ou splicing de proteínas mediado por inteínas ten lugar despois da tradución da proteína nos ribosomas a partir do seu ARNm, polo que é un fenómeno postraducional. Esta proteína precursora inicial saída do ribosoma contén tres segmentos: unha N-exteína seguida da inteína e despois unha C-exteína (N e C fan referencia á proximidade da exteína aos extremos N e C-terminais da proteína). Despois de que ten lugar o splicing, o resultado tamén se chama exteína (proteína definitiva sen a inteína).
As inteínas conteñen xeralmente dous dominios, un para o autosplicing, e outro que é un dominio endonuclease para a propagación. Os elementos para o autosplicing están nas porcións N- e C-exteínas, e a endonuclease está na inteína e intervén na propagación da inteína no xenoma. O dominio endonuclease non sempre está presente.
Historia A primeira inteína descubriuse en 1988 por medio da comparación de secuencias xénicas entre a ATPase vacuolar de Neurospora crassaBowman EJ, Tenney K, Bowman BJ Isolation of genes encoding the Neurospora vacuolar ATPase. Analysis of vma-1 encoding the 67-kDa subunit reveals homology to other ATPases. J Biol Chem. 1988 Oct 5;263(28):13994-4001. e de cenoria Zimniak L, Dittrich P, Gogarten JP, Kibak H, Taiz L.The cDNA sequence of the 69-kDa subunit of the carrot vacuolar H+-ATPase. Homology to the beta-chain of F0F1-ATPases. J Biol Chem. 1988 Jul 5;263(19):9102-12 (sen inteína) e o xene homólogo do lévedo Saccharomyces cerevisiae (con inteína) que foi primeiro descrito como un posible transportador de ións calcio.Shih CK, Wagner R, Feinstein S, Kanik-Ennulat C, Neff N. A dominant trifluoperazine resistance gene from Saccharomyces cerevisiae has homology with F0F1 ATP synthase and confers calcium-sensitive growth. Mol Cell Biol. 1988 Aug;8(8):3094-103 En 1990 Hirata et al.Hirata R, Ohsumk Y, Nakano A, Kawasaki H, Suzuki K, Anraku Y. Molecular structure of a gene, VMA1, encoding the catalytic subunit of H(+)-translocating adenosine triphosphatase from vacuolar membranes of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1990 Apr 25;265(12):6726-33. demostraron que a secuencia extra do xene do lévedo fora transcrito ao ARNm e só era eliminado na proteína despois da súa tradución. Desde entón, as inteías atopáronse nos tres dominios de seres vivos (eucariotas, bacterias e arqueas) e tamén en virus.
Moitas das inteínas atopadas tamén conteñen un dominio endonuclease que exerce unha función na propagación da inteína J. Peter Gogarten, Alireza G. Senejani, Olga Zhaxybayeva, Lorraine Olendzenski, Elena Hilario. Inteins: Structure, Function, and Evolution. Annu. Rev. Microbiol. 2002. 56:263–87. doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.160741 . De feito, moitos xenes teñen segmentos codificantes de inteínas non relacionados inseridos en diferentes posicións. Por estas e outras razóns, as inteínas (ou máis apropiadamente, os segmentos xénicos que codifican as inteínas) son ás veces chamados elementos xenéticos egoístas ou elementos xenéticos parasitos .
Nas bases de datos que conteñen todas as inteínas coñecidas (Inbase), hai 113 delas que están presentes nos eucariotas e teñen lonxitudes mínimas de 138 aminoácidos e máximas de 844. A primeira inteína atopada estaba codificada no xene VMA de Saccharomyces cerevisiae. Despois encontráronse noutros fungos (ascomicetos, basidiomicetos, cigomicetos e quitridios) e en diversas proteínas. Unha proteína remotamente emparentada coas proteínas que conteñen inteínas coñecidas, pero estreitamente emparentada coas proteínas hedgehog dos metazoos, tiña a secuencia de inteína de Glomeromycota. Moitas das inteínas recentemente descritas conteñen endonucleases e algunhas delas aparentemente son activas Perler, F. B. (2002). InBase: the Intein Database. Nucleic Acids Research, 30(1), 383-384. DOI 10.1093/nar/30.1.383. . A abundancia de inteínas nos fungos indica que se produciu unha transferencia lateral de xenes que conteñen inteínas. Nas bacterias e arqueas, coñécense, respectivamente, 289 e 182 inteínas ata agora (ano 2002). Non é sorprendente que a maioría das inteínas de bacterias e arqueas estean inseridas en proteínas metabólicas dos ácidos nucleicos, igual que nos fungos..
Mecanismo O mecanismo para realizar o splicing é un proceso natural análogo da técnica que produce proteínas de tamaño medio chamada ligazón química nativa, que foi desenvolvida ao mesmo tempo que se descubrían as inteínas.P. E. Dawson, T. W. Muir, I. Clark-Lewis, S. B. Kent (1994). "Synthesis of proteins by native chemical ligation". Science 266 (5186): 776–778. doi:10.1126/science.7973629. Ollivier, N. Dheur, J. Mhidia, R. Blanpain, A. Melnyk, O. (2010). Organic Letters 12 (22): 5238–41. doi:10.1021/ol102273u. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ol102273u.
O proceso comeza cun cambio de posición N-O ou N-S cando a cadea lateral do primeiro residuo (unha serina, treonina, ou cisteína) da porción da inteína da proteína precursora fai un ataque nucleofílico ao enlace peptídico do residuo inmediatamente anterior (que é o residuo final da N-exteína) para formar un intermediato éster (ou tioéster) lineal. Ocorre unha transesterificación cando a cadea lateral do primeiro residuo da C-exteína ataca o (tio)éster acabado de formar para liberar o extremo N-terminal da inteína. Isto orixina un intermediario ramificado no cal están unidas a N-exteína e a C-exteína, aínda que non por enlace peptídico. O último residuo da inteína é sempre unha asparaxina, e o átomo de nitróxeno da amida desta cadea lateral corta o enlace peptídico entre a inteína e a C-exteína, orixinando un segmento de inteína totalmente libre cunha imida cíclica terminal. Finalmente, o grupo amino libre da C-exteína ataca agora o (tio)éster que une as N- e C-exteínas. Un cambio de posición O-N ou S-N produce un enlace peptídico e a proteína ligada funcional.
Inteínas en biotecnoloxía As inteínas son moi eficientes no splicing de proteínas, e teñen importantes aplicacións en biotecnoloxía. Identificáronse máis de 200 inteínas; con tamaños que van de 100 a 800 aminoácidos. Utilizáronse técnicas de enxeñaría xenética coas inteínas para darlle aplicacións especiais como a semisíntese de proteínas e a marcaxe selectiva de elementos proteicos, que é útil para estudos de resonancia magnética nuclear de proteínas grandes.
A inhibición farmacéutica da escisión das inteínas pode ser unha ferramenta útil para o desenvolvemento de fármacos; a proteína que contén a inteína non poderá levar a cabo a súa función normal se a inteína non se escinde, xa que a súa estrutura quedará distorsionada.
Suxeriuse que as inteínas poderían ser útiles para conseguir a expresión alotópica de certas proteínas moi hidrófobas codificadas normalmente polo xenoma mitocondrial, por exemplo na terapia xénica . O carácter hidrofóbico destas proteínas é un obstáculo para a súa importación ás mitocondrias. Xa que logo, a inserción dunha inteína non hidrofóbica pode permitir que teña lugar esta importación. A escisión das inteínas despois da súa importación restauraría despois a forma normal da proteína.
O uso de etiquetas de afinidade para purificar proteínas recombinantes foi moi utilizado, xa que permite a acumulación de proteínas recombinantes con poucas impurezas, pero a etiqueta de afinidade debe ser eliminada por proteases no paso final. O paso extra da proteólise crea o problema da especificidade da protease para eliminar a etiqueta de afinidade da proteína recombinante. Tamén debe eliminarse o seu produto de dixestión. Este problema pode ser evitado fusionando a etiqueta de afinidade a unha inteína que se pode autoescindir nun medio controlado. A primeira xeración de vectores de expresión deste tipo usaba unha inteína de VMA (Sce VMA) de Saccharomyces cerevisiae modificada. Chong et al. (1997) utilizaron o dominio de unión á quitina de Bacillus circulans como etiqueta de afinidade e fusionaron esa etiqueta na inteína Sce VMA modificada. A inteína modificada experimenta unha reacción de autoclivaxe no seu enlace peptídico N-terminal por 1,4-ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol (β-ME) ou cistina a baixa temperatura e nun amplo rango de pH. Despois da expresión da proteína recombinante, o homoxenado celular pásase por unha columna que contén quitina. Isto permite que o dominio de unión á quitina da proteína quimérica se una á columna. Ademais, cando se baixa a temperatura e as moléculas descritas antes pasan pola columna, a proteína quimérica sofre autosplicing e só se elúe a proteína diana. Esta nova técnica elimina o paso da proteólise e a Sce VMA modificada queda na columna unida á quitina polo dominio de unión á quitina Chong, S., Mersha, F. B., Comb, D. G., Scott, M. E., Landry, D., Vence, L. M., Perler, Francine B, et al. (1997). Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element. Gene, 192(2), 271-281. DOI 10.1016/S0378-1119(97)00105-4. .
Recentemente, as inteínas empezaron a utilizarse para purificar proteínas baseándose en péptidos autoagregados. Os polipéptidos similares á elastina (ELPs) son unha útil ferramenta biotecnolóxica. Fusionados con proteínas diana, tenden a formar agregados dentro das células Fong, B. a, & Wood, D. W. (2010). Expression and purification of ELP-intein-tagged target proteins in high cell density E. coli fermentation. Microbial cell factories, 9(1), 77. BioMed Central Ltd. DOI 10.1186/1475-2859-9-77. . Isto elimina o paso cromatográfico necesario para a purificación das proteínas. Os polipéptidos similares á elastina utilizáronse na proteína de fusión da inteína, para que os agregados puidesen ser illados sen cromatografía (por centrifugación) e despois a inteína e a etiqueta puidesen ser clivadas dunha maneira controlada para liberar a proteína diana na solución. Este illamento de proteínas pode facerse usando un fluxo continuou, que rende gran cantidade de proteína, facendo que o proceso sexa máis eficiente economicamente cós métodos convencionais . Outros grupos de investigadores utilizaron etiquetas autoagregantes máis pequenas para illar a proteína diana. Utilizáronse os pequenos péptidos anfipáticos 18A e ELK16 para formar proteína agregante autoclivante Xing, L., Wu, W., Zhou, B., & Lin, Z. (2011). Streamlined protein expression and purification using cleavable self-aggregating tags. Microbial cell factories, 10(1), 42. BioMed Central Ltd. doi 10.1186/1475-2859-10-42. .
Nomenclatura das inteínas A primeira parte do nome dunha inteína está baseada nunha abreviación da nomenclatura binomial do nome científico da especie na que foi atopada, e o segundo está baseado no nome do xene correspondente da exteína. Por exemplo, a inteína encontrada en Thermoplasma acidophilum e asociada coa subunidade A da ATPase vacuolar (VMA) denomínase "Tac VMA".
Normalmente, como neste exemplo, só se usan tres letras para especificar o organismo, pero isto pode variar. Poden engadirse máis letras para indicar a cepa. Se está codificada máis dunha inteína no xene correspondente, dáselle a cada unha un sufixo numérico empezando polo extremo 5' do xene e acabando no 3' ou, outras veces, segundo a orde en que foron identificadas (por exemplo, "Msm dnaB-1").